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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第二节 膜片钳的多种记录形式
2009-06-02 16:59  

 

在膜片钳技术的发展过程中,主要形成了四种记录模式,即细胞贴附模式(cell-attached modeon-cell mode)、膜内面向外模式(inside-out mode)、膜外面向外模式(outside-out mode)、常规全细胞模式(conventional whole-cell mode)和穿孔膜片模式(perforated patch mode),如图11-2所示。根据研究目的和观察内容的不同,可采取相应的记录方法。此外,还有带核膜片记录、人工脂膜的膜电流记录、自动化膜片记录、平面膜片记录等其他记录方式。

11-2

1. 细胞贴附模式(cell-attached modeon-cell mode) 当吸管与细胞简单接触,造成低电阻密封时,给吸管内以负压吸引,吸管与细胞膜的封接将提高几个数量级,形成高阻抗封接(giga-seal),这时直接对膜片进行钳制,高分辨测量膜电流,这种方式称为细胞贴附式(cell-attached modeon-cell mode)。其优点在于不需要灌流,细胞质及调控系统完整,可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动,但不能人为直接地控制细胞内环境条件,不能确切测定膜片上的实效电位。此外,即使在浴液中加入刺激物质,也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面,相反的,如果膜片离子通道对浴液中的刺激物质有反应,则说明这种刺激物质是经过某些细胞内第二信使的介导间接地起作用。

2. 膜内面向外模式(inside-out mode) 在巨阻抗封接后如向上提起电极,在微电极尖端可逐渐形成一封闭的囊泡,并与细胞脱离,将其短时间地暴露于空气,可使囊泡的外面破裂,与电极相连的膜片与整个细胞相分离,而形成膜内面向外的模式(inside-out mode)。此种构型下,能较容易改变细胞内的离子或物质浓度,也能把酶等直接加于膜的内侧面,因此适用于研究胞内激素和第二信使物质如145-三磷酸肌醇、cAMPcGMPCa2+等对离子通道型受体功能的调节。

将细胞贴附模式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏,经破坏孔调控细胞内液并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录,这种模式被称为开放细胞吸附膜内面向外模式(open cell-attached inside-out mode)。这种方法的细胞体积越大,破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小,均可导致细胞质因子外流变慢。

3. 膜外面向外模式(outside-out mode) 如果从上述的全细胞模式将膜片微电极向上提起可得到切割分离的膜片,由于它的细胞膜外侧面面对膜片微电极腔内液,膜外面自然封闭而对外,所以这个模式被称为膜外面向外模式(outside-out mode)。此构型多用于研究细胞膜外侧受体控制的离子通道,研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶C等活动性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四烯酸等对离子通道型受体功能的调节。

此外,在实验条件下,分离小块细胞膜片接触模拟状态下的膜内或膜外离子环境,从而可用来研究药物对电压和化学门控性通道的影响,从分子水平上解释药物的作用机制,也有助于研制开发特定的药物来作用于与某些疾病相关的离子通道,而产生最佳的治疗效果。

4. 常规全细胞模式(conventional whole-cell mode)和穿孔膜片模式(perforated patch mode) 在形成巨阻封接后,如进一步在吸管内施加脉冲式的负压或加一定的电脉冲,使吸管中的膜片破裂,吸管内的溶液与细胞内液导通。由于吸管本身的电阻很低,这时可形成常规全细胞模式或孔细胞模式(conventional whole-cell modehole cell mode)。其优点在于容易控制细胞内液成分,适合于小细胞的电压钳位,但全细胞记录的是许多通道的平均电流,须通过各种通道阻断剂来改变内部介质以分离电流,是当前细胞电生理研究中应用最广泛的一种模式。其不足之处在于胞内可动小分子可从细胞内渗漏(wash-out)到膜片微电极腔内液中。

为克服胞质渗漏的问题,HornMarty将与离子亲和的制霉菌素(nystatin)或两性霉素Bamphotericin B)经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜上,在已形成细胞贴附模式的膜片上形成只允许一价离子通过的孔,用此法在膜片上形成很多导电性孔道,借此对全细胞膜电流进行记录,这种方法被称为穿孔膜片模式(perforated patch mode)或制霉菌素膜片模式(nystatin-patch mode)。该模式的胞质渗漏极为缓慢,局部串联阻抗较常规全细胞模式高,钳制速度缓慢,故又称为缓慢全细胞模式(slow whole-cell mode)。运用穿孔膜片钳技术,可以防止细胞内物质的流失而影响其功能,具有特殊的生理意义和实用价值。

以上提到的四种膜片钳记录中都是通过一根电极对膜片或细胞进行电压钳制,但相同的电极电压所造成的钳制水平不同,以Vp代表电极电位,Vm代表膜电位,则:

细胞贴附式:   Vm=细胞静息电位-Vp

内面向外:      Vm =-Vp

外面向外:      Vm=Vp

全细胞记录:   Vm=Vp

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