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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第一节 细胞培养的基本技术
2009-06-02 17:13  

 

一、清洗

新采用和重新使用的培养器皿,都要严格清洗,以防各种有害物质对培养细胞损害。培养用的塑料器皿目前主要依靠进口,均已无菌密封包装,可直接使用。对于塑料瓶盖或胶塞等,可水中浸泡后用2NaOH煮沸1020min,自来水中浸泡和蒸馏水漂洗23次,晾干备用。细胞培养中的绝大部分器皿系玻璃制品,清洗过程为以下步骤。

1. 浸泡 新使用或重复使用的玻璃器皿须经5%盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min,水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质,并消除其弱碱性。

2. 刷洗 浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。

3. 酸浸 刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干,以免造成酸浸液稀释,影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用,操作过程需戴防护用具。

4. 冲洗 浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗,吸管需冲洗10min,器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上,不留任何酸浸液残迹,然后用蒸馏水漂洗23次,烘干备用。要求干净透明,无油烟,不能残留任何有害物质及化学药品等。

二、消毒

1. 包装 器材经清洗烤干或晾干后,先应严格包装,然后再行消毒灭菌处理,以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

2. 消毒 消毒灭菌随物品的不同,而采用不同的方法。

1)紫外线:主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后,均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

2)消毒剂:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内桌椅和物体的消毒可用0.1%新洁尔灭、过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。实验室、无菌室的消毒可用甲醛熏蒸(高锰酸钾57.5g,加40%甲醛1015ml,混合放入一开放容器内,立即可见白色甲醛烟雾,房间密闭24h即可)。

3)干热消毒:多用于玻璃器皿消毒,干热烤箱1804560min

4)湿热消毒:培养液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa115℃)高压灭菌10min;布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa121.3℃)高压灭菌1520min

5)滤过消毒:用孔径200450nm大小的滤板可除去培养液和试剂中的细菌和霉菌等。用200nm孔径的滤板通过两次,可使支原体达到某种程度的去除,但不能除去病毒。滤器分为负压和加压式两种。过滤的液体量很少时,可选用注射器微量滤膜滤器。

660Co照射:不耐热的塑料制品或一次性用品的灭菌可经包装后,用γ射线照射消毒。

三、无菌操作

无菌操作是防止污染、决定培养是否成功的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力,在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。工作前对手部需清洗消毒,进无菌操作室时戴口罩和穿工作服。不能用手直接触及已消毒器皿内部。打开培养瓶前或封闭瓶口前须火焰烧灼瓶口等。

四、取材

取材应注意无菌操作,防止污染。污染组织应放入含两性霉素B2μg/ml)、青霉素(500u/ml)、链霉素(500μg/ml)的培养液中浸泡1020min。取材后应立即进行培养。如因故不能培养时,应在无菌条件下,把组织块切成1cm3大小置于培养液中37℃贮存。存放时间不宜超过24h

1. 源自人体的肿瘤和其他病理组织的取材、贮存和运送须注意防止污染。

2. 取血:多采用静脉血,注意无菌操作,如需应用肝素等抗凝剂,也要注意消毒处理。血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液,可采用离心法分离,5001000rmin,离心510min即可。

3. 动物组织:动物皮毛易隐藏微生物,且不易消毒,应特别注意无菌操作。

五、细胞分散法

1. 机械分散 对于脑、胚胎、肿瘤等软组织,先用组织匀浆器研磨组织,再通过细胞筛获得单细胞悬液。

2. 胰蛋白酶消化 适合于消化间质较少的软组织,传代细胞消化也常采用,是应用较广泛的消化酶,由于Ca2+ Mg2+ 对胰蛋白酶活性有一定抑制作用,因此须用不含这些离子的缓冲液配制。将组织剪成1mm3大小,置于容器中,加入3050倍体积的0.25%胰蛋白酶液,消化3060min

3. 胶原酶消化 对胶原有较强的消化作用,适用消化纤维组织、上皮组织及瘤组织等。胶原酶的使用终浓度为200U/ml0.10.3μg/ml,其消化作用缓和。一般将35倍胶原酶溶液加入已剪碎的组织块中,数小时或10余小时后,可见组织块逐步变小至几乎看不见,原来澄清的消化液转变成混悬液时,可以终止消化,如组织块较大、细胞量较多时,可于消化期间换消化液一次。消化液经低速离心5min后,去上清液,加入20%小牛血清培养液,轻轻打散细胞团,制成细胞悬液。

4 EDTA溶液分散 使用浓度为0.02%EDTA溶液。常用于传代细胞的消化,作用温和,毒性小。

六、淋巴细胞分离法

取肝素抗凝血1mlHanks1ml稀释后,沿试管壁慢慢加入4ml淋巴细胞分离液之表面,勿与分离液混合。然后2000r/min水平离心20min,管内分4层,自上而下依次为血浆、单个核细胞(位于细胞分离液上界与血浆下界的中间呈白色雾状层)、颗粒白细胞(位于淋巴细胞分离液下界与底层红细胞上界的交界处)和红细胞(位于管底)。用毛细吸管沿管壁轻轻吸出的淋巴细胞层。然后用Hanks液洗两次,每次2000r/min离心10min,最后计数供用。

七、细胞计数

待测细胞悬液0.1mlD-Hanks0.8ml0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色),混合后滴入血球计数板内。于低倍镜下计数4角的4个大方格内的活细胞(透明未着色)总数,然后用下式计数:

细胞数/每毫升原液=(4大方格内活细胞数/4)×104×稀释倍数

细胞存活率=(活细胞数/活细胞数+死细胞数)×100

在计数时遇到对大方格压线的细胞,应按数上不数下,数左不数右的原则进行计数。

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