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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第一节 染色体制备
2009-06-02 17:26  

一、 人外周血染色体制备

1. 实验原理 人的外周血淋巴细胞培养方法是1960年由Moorhead 提出来的。正常情况下,人外周血小淋巴细胞都处在G1期(或G0期),但在体外给予一定的条件,进行培养,经72 h就可获得大量的有丝分裂细胞。这种取材简易、用血量少的培养方法已被广泛采用。

在培养液中加入植物血凝素(PHA),淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞,进入有丝分裂。短期培养后,经秋水仙素处理,可抑制细胞分裂时纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期,同时它可改变细胞质的黏度,引起染色体在细胞质中分散。经低渗和固定,即可得到大量的、分散效果好的染色体分裂象。人体的1ml外周血中一般含有约(13)×106个小淋巴细胞,足够染色体标本制备和分析之用。本节介绍人外周血淋巴细胞的悬浮培养法,以及染色体标本的制备。

2. 试剂与器材

12ml注射器、培养瓶、刻度吸管,需15磅灭菌20min。离心管、吸管、量筒、载玻片,经洗液按常规清洗、烘干备用。

2)超净工作台,恒温培养箱,天平,离心机、显微镜等。

3)试剂:

① 培养基的配制:

RPMI 1640培养基     4ml

小牛血清            1ml

青霉素和链霉素      100IU/ml

PHA                 0.2ml

肝素                1小滴

5% NaHCO3pH7.27.4, 4℃备用。

② 肝素:称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,灭菌。

③ 秋水仙素:生理盐水配制成20μg/ml浓度,灭菌,分装,置-20℃。

④ 低渗液:0.075mol/L KCl

⑤ 固定液: 甲醇∶冰乙酸(31),临时配制。

Giemsa工作液:1份原液和9份磷酸缓冲液,临时配制。

⑦ 磷酸缓冲液:1/15mol/L Na2HPO41/15mol/L KH2PO4等体积混合。

5% NaHCO3灭菌滤器抽滤备用。

3. 实验步骤

1)接种,培养。

① 在无菌条件下,用灭菌注射器吸取0.2%肝素液(生理盐水配制,灭菌)0.2ml,湿润针筒后,采静脉血12ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。

② 无菌条件下,将肝素化血液滴入至外周血培养基内,每5ml培养液内滴入血滴2830滴(7号针头)轻轻混匀。

③ 置37℃恒温箱内,静止培养6872h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象,可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。

④ 终止培养前23h,加入浓度为20μg/ml的秋水仙素,每5ml培养基中用7号针头,加34滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后,再放入恒温箱内,继续培养23h,以积累较多停止在中期的分裂象。

2)制片。

① 收获细胞:由恒温箱取出培养瓶,用吸管充分吹打培养瓶瓶壁,使细胞全部脱离瓶壁,然后将细胞液移至锥形离心管内,1500/min,离心10min,去上清液。

② 低渗处理:加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml,反复吹打(约一百次)后,置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。

③ 预固定:加入新鲜制备固定液1ml(甲醇∶冰醋酸=31),轻轻混匀。

④ 离心:2000/min,离心10min,吸弃上清液。

⑤ 固定:沿离心管壁慢慢加入固定液8ml,轻轻混匀,固定10min

⑥ 离心:同上,吸去上清液。

⑦ 再固定:加固定液8ml,混匀,固定10min

⑧ 离心:同上,吸去上清液。

⑨ 制细胞悬液:根据细胞量多少,加入适量固定液,充分混匀,制成细胞悬液。

⑩ 滴片:取出预先经冰水浸泡的载玻片,用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片,每片约滴23滴细胞悬液,使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制35张标本片。

{11} 染色:标本晾干后,即可用染液(Giemsa液原液1份,pH6.8的磷酸缓冲液9份)染色15min,自来水冲洗后(从背面冲洗)晾干。

3)镜检:人类每个体细胞有46条染色体,根据染色体的长度和着丝粒位置的不同,可以分成22对常染色体和一对性染色体,男子是46XY;女子是46XX

二、体外培养细胞的染色体标本制备

1. 体外培养的细胞,在倒置镜下观察到有较多的分裂细胞(传代后24h,圆形发亮的细胞)时,加入秋水仙素溶液,终浓度为0.3μg/ml培养液;

2. 继续培养3h

3. 胰酶消化收集细胞至离心管;

4. 离心1000/min,离心10min,去上清;

5 Hanks液洗,离心,去上清;

6. 低渗处理:加入0.075mol/L KCl溶液8ml,置37℃恒温水浴中30min,用吸管稍吹打(同上);

7. 固定及制片如外周血染色体的制备。

三、注意事项

1. 秋水仙素处理时间过长,分裂细胞多,染色体短小;反之,则少而细长,故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。

2. 固定液应在使用前临时配制。

3. 载玻片一定要洁净,否则染色体分散不好。

4. 染色体分裂指数低:患者处于非常时期(放、化疗期);培养基营养成分不良;培养基pH偏低或偏高;PHA过量或不足;小牛血清质量不高;培养箱温度偏低;秋水仙素处理时间过短。

5.接种的血样愈新鲜愈好。

6. 培养过程中,如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡,使凝块散开,继续放回37℃恒温箱内培养。

附:

Carnoy固定液:

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性,还要能够增强染色体的嗜碱性,达到优良染色效果。单纯的固定液一般难以达到这些要求,因此在实验中使用两种混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=31)每次使用前需临时配制,长时间放置影响固定效果,固定时间15min24h,冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例,冰乙酸比例增加,利于细胞膨胀、染色体铺展,但易导致细胞破裂、染色体散失。

低渗液(hypotonic solution

低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液,渗透压低于组织液,与外周血混在一起时,水分迅速进入细胞,使其膨胀,甚至破裂,获得分散良好的染色体分裂象。常见的低渗液:水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(0.65mol/L)、氯化钾(0.075mol/L)等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展,同时可使黏附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态。实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液,其优点有:①染色体轮廓清楚,可染色性强,染色时间短。②用于显带染色时能充分显示带型特点。低渗处理为37℃,2530min,以预实验条件为准。

Giemsa染液

Giemsa原液配制:称Giemsa粉末0.5g,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90120min。加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存。使用时按要求用PBS稀释,一般稀释10倍。

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