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第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
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第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
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附录

 
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第一节 核酸探针标记及原位杂交
2009-06-02 17:35  

一、核酸探针标记

核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。

核酸探针根据核酸的性质,可分为DNARNA探针;根据标记物不同,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面主要介绍双链DNA探针及其标记方法和光敏生物素标记探针的方法。

()切口平移法(nick translation)标记双链DNA探针

当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3?蒺羟基末端。同时该酶具有从5?蒺→3?蒺的核酸外切酶活性,能从切口的5?蒺端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3?蒺端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50500bp。切口平移反应受几种因素的影响:① 产物的比活性取决于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度;② DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小;③ DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA

1. 材料

1) 设备:高速台式离心机,恒温水浴锅等。   

2) 试剂: ①10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl(pH7.2)0.1mol/L MgSO410mmol/L DTT100μg/ml BSA。②未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。③[α-32P]dCTP[α-32P]dATP 400 Ci/mmol, 10μCi/μl。④ E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4U/μl)溶于50μg/ml BSA1mmol/L DTT50%甘油,50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。⑤DNA酶Ⅰ1mg/ml。⑥EDTA 200mmol/L(pH8.0)。⑦10mol/L NH4Ac

2. 方法

1)按下列配比混合:未标记的dNTP 10μl10×切口平移缓冲液5μl、待标记的DNA 1μg[α-32P]dCTPdATP(70μCi) 7μlE.coli DNA聚合酶4UDNA酶Ⅰ1μl,加水至终体积 50μl

2)置于15水浴60min

3)加入5μl EDTA终止反应;

4)反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。   

3. 注意事项

13H32P35S标记的dNTP都可用于探针标记,但通常使用[α-32P]-dNTP

2DNA酶Ⅰ的活性不同,所得到的探针比活性也不同,DNA酶Ⅰ活性高,则所得探针比活性高,但长度比较短。

(二)随机引物合成法

随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400600个,可以获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

1. 材料

1)设备:高速台式离心机,恒温水浴锅等。   

2)试剂:①随机引物(随机六聚体或断裂的鲑鱼精子DNA)。②10×随机标记缓冲液:900mmol/L HEPES (pH6.6)10mmol/L MgCl2。③Klenow片段。④20mmol/L DT。⑤未标记的dNTP溶液:dGTPdCTPdTTP溶液,各5mmol/L。⑥[α-32P] dATP:比活性3000Ci/mmol10μCi/μl。⑦缓冲液A50mmol/L Tris·ClpH7.5)、50mmol/L NaCl5mmol/L EDTApH8.0)、0.5% SDS

2. 步骤

1200ng双链DNA(1μl)7.5ng随机引物(1μl)混合后置于Eppendorf管内,水浴煮沸5min后,立即置于冰浴中1min

2)与此同时,尽快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管内混合下列化合物:20mmol/L DTT 1μl、未标记的dNTP溶液 1μl10×随机标记缓冲液 1μl[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol10μCi/μl) 3μlddH2O 1μl

3)将步骤(1) Eppendorf管中的溶液移到步骤(2)管中。

4)加入5U(1μl) Klenow片段,充分混合,在微型离心机中以12 000g离心12s,使所有溶液沉于试管底部,在室温下保温316h

5)在反应液中加入10μl缓冲液A后,将放射性标记的探针保存在-20下备用。同时计算放射比活性。   

3. 注意事项

1)引物与模板的比例应仔细调整,当引物高于模板时,反应产物比较短,但产物的累积较多;反之,则可获得较长片段的探针。

2)模板DNA应是线性的,如为超螺旋DNA,则标记效率不足50%

(三)光敏生物素标记方法

光敏生物素是一种化学合成的生物素衍生物。其分子中含有可光照活化的叠氨代硝苯基。醋酸盐易溶于水,在水溶液中光敏生物素醋酸盐与待标记核酸混合,在强可见光短暂照射下即能与核酸的碱基反应,生成光敏生物素标记核酸探针。一般在规定条件下,核酸中每100150bp可结合一个生物素。这种生物素标记的探针不会影响探针序列与其互补和新的靶序列之间的杂交。该标记方法的优点是简便易行,单、双链DNARNA都能以此法标记形成稳定的共价结合,且生成的标记探针为橙红色,便于观察反应结果。此法标记的探针可检出0.5pg滤膜结合DNA。此外,标记探针稳定性好,-20可保存12个月。

1. 材料

1)仪器 LYQ 12100卤钨灯、台式离心机。

2)器皿 微量移液器、Tip头,光标用冰模、墨镜、尺子。

3)试剂 ①光敏生物素醋酸盐为白色干粉,分子量为533。在暗室中用灭菌双蒸水溶解,使成1mg/ml。小量分装,避光下-20可稳定保存46个月。②仲丁醇或正丁醇。③TE缓冲液100 mmol/L Tris·Cl(pH 9.0)1 mmol/L  EDTA。④无水乙醇、70%乙醇。⑤3 mol/L醋酸钠(pH5.2)。⑥0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)或灭菌dH2O

2.方法

1)强光源照射标记:在暗室安全灯下,向微量离心管中加入15μg待标记核酸(DNARNA)15μg光敏生物素并混匀。将反应管敞口插入冰模中,液面距光源10cm,用LYQ 12-100卤钨灯光照标记30min。加入70μlTE缓冲液。此后操作在正常光线下进行。

2)仲丁醇提取:加入100μl(等体积)仲丁醇(或正丁醇),充分混匀,4000g离心2min。吸弃上相,加入等体积仲丁醇(或正丁醇)重复萃取一次。

3)乙醇沉淀浓缩:吸弃上相,计量下相(溶液可浓缩至40μl左右)。加入1/10体积3mol/L的乙酸钠(pH52)2倍体积冷无水乙醇,混匀。-20沉淀过夜或-70沉淀1h以上。以410 000g离心15min。弃上清,再用100μl 70%冷乙醇以4 10 000g离心15min。离心洗涤沉淀(注意勿将沉淀吹散)

4)标记核酸的保存:真空干燥或室温风干标记沉淀物,将其溶于适量0.1 mmol/L EDTA溶液或灭菌双蒸水中。适量分装后-20避光保存备用。

3. 注意事项

1)避光下准备反应体系:由于光敏生物素醋酸盐对光敏感,应避免光照。在分装试剂及核酸与光敏生物素混合时应在暗室安全灯下操作。

2)核酸纯度:由于光敏生物素能与任何有机物反应,因此用做标记探针的核酸要高度纯化。用作标记探针的核酸最好不用Tris溶液溶解,Tris中所含氨基会干扰标记。

3)光照标记时间:光照时间不应太长。如果核苷酸上标记光敏生物素过多,会因空间位阻而影响探针与靶序列的杂交。一般认为,每100400bp标记上一个光敏生物素分子。此法适用于大于200bp的核酸片段的标记,小片段标记率不高。

4)光敏生物素用量:光敏生物素的活性基团是碱基,反应中加量不能太多,否则会产生氮气泡。一般为1 μg DNA12μg光敏生物素。

二、原位杂交

原位杂交(in situ hybridization)用特定标记的已知碱基序列核酸作为探针与组织、细胞中待检测核酸按碱基互补配对的原则在原位进行特异性结合,形成杂交体,然后用与标记物相应的监测系统,通过免疫组织化学方法在被检测核酸原位进行细胞内核酸定位。原位杂交可根据检测物而分为细胞内和组织切片原位杂交;根据其用探针及检测核酸的不同可分为DNA-DNARNA-DNARNA-RNA杂交。根据标记方法不同可分为放射性探针和非放射性探针。

其基本方法包括:固定、切片、杂交、显色等主要步骤。

()取材与标本固定

1. 取材 对于原位杂交所用的材料要尽可能新鲜,为了防止RNA的降解,取材要迅速,取材后要尽快固定或冷冻保存。

2. 固定 进行原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理,固定的目的是为了①保持细胞形态原有结构;②最大限度保存细胞内的DNARNA的水平;③使探针易于进入细胞或组织内。

3. 固定液 常用固定液有10%甲醛、4%多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。这些固定液都有不同的优缺点因此要根据具体的实验对象,选择最佳的固定液。

4. 固定方法 组织标本取材后,迅速放入固定液中24h,取材组织大小为1cm×1cm×0.5cm,不宜太大。必要时,动物组织可进行灌流固定,然后将组织按要求取材放入20%蔗糖中,4过夜,次日可行冰冻切片。

()切片及细胞标本的制备

1. 载玻片的处理 因为原位杂交一般在载玻片上进行,所以载玻片必须保持清洁且不能有任何核酸酶的污染。一般载玻片可先经洗衣粉浸泡过夜,用流水冲洗、酸中浸泡48h,再用流水冲洗,双蒸水洗23次。在160烤箱中烘烤24h。亦可经15高压灭菌20min处理,可将载玻片上的核酸酶消除。

2. 组织切片与预处理

1)冰冻切片:新鲜组织也可在取材后,直接置入液氮中迅速骤冷,冷冻切片后,4%多聚甲醛固定510min,也可保存在-70中待用。杂交前切片迅速恢复至室温并干燥,0.1mol PBS洗三次,2×SSC10min,滴加预杂交液室温孵育1h

2)石蜡切片:组织固定后,常规石蜡包埋切片,可长期保存,随时用于原位杂交。杂交前切片经①二甲苯脱蜡2次,每次10min;②纯酒精洗2次,每次5min;③空气干燥5min;④梯度酒精复洗95%,80%,70%各1min;⑤0.1 mol PBS3次,每次5min;⑥2×SSC10min;⑦滴加预杂交液于湿盒内室温孵育1h

3)培养细胞:每张载玻片滴加200μl浓度为1×105/m1的细胞悬浮液,空气干燥12min制成细胞涂片,也可直接用培养细胞盖片。上述细胞片经酒精或多聚甲醛固定5min,其余步骤同冰冻切片。

()试剂配制

配制溶液过程中均需戴手套,液体配制均用超净水,所用瓶子均经160烘烤4h,主要目的是去除RNA酶。

1 DEPC水 将DEPC1‰浓度加入超净水中,充分混合后静置过夜,15~20min高压消毒,之后室温避尘存放。

2 0.1mol PBS pH 7.4

A液:0.1mol NaH2PO4NaH2PO4 (MW156.012H2O) 1.56gDEPC 100.00m1

B液:0.1mol Na2HP04Na2HPO4 (MW358.1412H2O) 17.907gDEPC 500.00m1

A液:B液=9.540.5 NaCl使其浓度达0.85%。

3 20×SSC 为NaCl(3mol/L) 8.765gNa3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410gDEPC50.00m1

4 4%多聚甲醛(pH 7.4) 为多聚甲醛4g0.1mol PBS 100m1

5. 缓冲液

1) 缓冲液Ⅰ(pH 7.5) 为1mol Tris-HCl 100ml5mol NaCl 20ml;消毒超净水加至1000ml

2) 缓冲液Ⅱ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml5mol NaCl 20ml1molMgCI 50ml;消毒超净水加至1000ml

3) 缓冲液 Ⅲ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml1molEDTA 5ml5mol NaCl 20ml1molMgCI 50ml;消毒超净水加至1000ml

6. 去离子甲酰胺 将阴阳离子交换树脂各5g加入50ml甲酰胺中,待树脂下沉后用上清液。

7 50%硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水,不断搅动使之完全溶解。

8 50×Denhardt's液 为1Fico11type 400(聚蔗糖) 0.2g1PVP(聚乙烯砒硌烷酮)0.2g1BSA(牛血清白蛋白)0.2gDEPC 20.0ml

9. 预杂交液 为去离子甲酰胺5.0m120×SSC 2.0m1;鲑鱼精DNA (10mg/m1) 0.5ml(沸水变性10min);酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m150%硫酸葡聚糖 2.00m150×Denhardt?s 0.20ml

()杂交与显色

1.杂交 将已标记的探针加入预杂交液即成为杂交液(探针浓度为1μg/m1),切片经2×SSC短暂浸洗后,滴加杂交液,于湿盒内置3742孵育过夜。然后依次经2×SSC室温浸洗1hl×SSC室温浸洗lh0.5×SSC 37浸洗30min0.5×SSC室温浸洗30min。注意滴加杂交液时切片勿干燥。

2. 显色 以下各步均在室温下进行。

1)缓冲液I1min

2)用含2%正常羊血清和0.3TritonX-100的缓冲液I孵育切片30min

3)用含1%正常羊血清和0.3TronX-100的缓冲液I稀释羊抗Dig抗体。

4)将抗体稀释液滴加在切片上,封口膜覆盖,湿盒内4孵育过夜。

5)缓冲液I10min

6)缓冲液Ⅱ洗10min

7)加显色液,封口膜覆盖,避光室温孵育220h,随时镜检,当显色满意时入缓冲液Ⅲ终止显色。

显色液临用前配,其配方为:①NBT 45μl;②X-Phospllate 35μl;③左旋咪唑      2.4mg;④缓冲液Ⅱ 加至10ml

8)常规脱水、透明、封固。

结果:杂交阳性信号为紫蓝色颗粒。

()原位杂交对照试验 

同免疫组织化学染色对照一样,为证明原位杂交实验操作的准确性和实验结果的特异性,需要设置一系列对照实验,具体的各种对照实验的设置及其意义请参考原位杂交专著,以下仅介绍几种常用的对照实验。

1. 省去标记探针 在做原位杂交时,以PBS或预杂交液替代杂交液,结果应为阴性,这是一种简便而有意义的阴性对照实验。如省去标记探针仍出现阳性反应,这一定是假阳性。

2. 自身对照 用同一组织切片或涂片上与靶序列无关的其他结构作对照。阳性与阴性结构同在一个视野中,相互印证,这本身就是对阳性反应的特异性对照。

3. 阴性对照 用已知不存在相应靶序列的组织标本杂交,结果应为阴性。阴性对照可排除在杂交过程中由于非特异性杂交反应等因素造成的假阳性结果。

4. 阳性对照 用已知含靶序列的组织切片与待检标本同样处理,结果应为阳性,称阳性对照。通过阳性对照可证明杂交过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准,实验方法可靠。尤其当待检标本为阴性时,阳性对照片呈阳性反应可排除待检标本假阴性的可能。故若预期杂交结果为阴性时,就必须设阳性对照,当阳性对照亦不显色,就证明杂交过程的某一步骤或所用试剂问题。      

                                           (陈健康)

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