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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第三节 单克隆抗体技术
2009-06-03 19:58  

1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。
    1. 杂交瘤的基本原理 杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇(Polyethylene Glycol ,PEG)的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合,然后通过有丝分裂细胞核合而为一,形成新的杂交细胞,简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGRPT),在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物,并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖(传代)的特性,因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。
    2. 杂交瘤细胞制备
   (1)骨髓瘤细胞的培养:骨髓瘤细胞(NS-1或SP2/0)在含10~15的小牛血清完全培养液中培养处于对数生长期时,此时细胞浑圆、透亮,大小均一,排列整齐,呈半致密分布。选择处于旺盛生长,形态良好的对数生长期细胞供融合用。
   (2)免疫小鼠:选用8~12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性(蛋白质),可按每只鼠一次剂量为10~100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀,分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内,间隔2~4周同法重复,经1月后,再用10~100μg(0.1~0.2ml)抗原作静脉或腹腔加强免疫。细胞与微生物表面抗原一般具有较高的免疫原性,可不加佐剂,直接经腹腔或静脉注入(1~2)×107细胞。一般采用融合前3~4d大剂量静脉注入抗原,然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高,融合率较高。
   (3)脾细胞制备:①放血处死小鼠,浸泡在75%的酒精中消毒。②在无菌条件下取脾,至含培养液的小平皿内,去掉脂肪和结缔组织,用5ml无血清培养液冲洗一次。③将脾细胞置细胞网上,加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞,将脾细胞收集到离心管内(50ml),加10~20ml培养液,离心(800~1000r/min,10min),弃上清后计数备用。
   (4)饲养细胞制备:在体外培养时,单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖,必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。
    ①放血处死小鼠,浸泡在75%的酒精中消毒。②小心剪开腹部皮肤,用小镊子挑起腹膜,注入5ml无血清培养液,用镊子轻揉腹腔,将注入液体回抽,反复注入、抽吸2~3次。③将收集的细胞悬液注入50ml的离心管中,加20ml无血清培养液洗涤一次。④用含血清培养液(HAT)15~20ml调至4×105个细胞/ml,用吸管混匀后,接种到96孔板,每孔加0.1ml,置于37℃、5%CO2孵箱中。
   (5)细胞融合(杂交) :①分别吸取含107个骨髓瘤细胞和108个脾细胞悬液,加入50ml的离心管中,充分混匀,并加1640培养液至20ml,离心(1000 r/min,10min)。②弃上清,用手指轻击离心管底部,使沉淀混匀如糊状。然后置37℃水浴中。③取预热37℃的50% PEG 0.7ml,1min内在37℃水浴中边滴边摇动加入离心管中,使细胞保持在均匀状态。然后在37℃水浴中静置1.5min。④立即在2min内加37℃预温的RPMI 1640培养液15ml,以稀释PEG而失去的作用。开始要一滴一滴加,即可见细胞凝集成小块。操作宜轻柔,不损伤细胞,以免影响细胞融合。⑤以1000 r/min,离心7min,弃上清液,加25ml HAT培养液,轻轻混匀,滴加入含有巨噬细胞饲养液的96孔板中,每孔0.1ml。
    3. 杂交瘤细胞的选择性培养
   (1)培养:将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中,置于含5%~7% CO2,37℃饱和湿度培养箱中培养。
   (2)换液:每2~3天更换一半量的培养液一次,在融合两周内使用HAT培养液,在第12~13天用HT培养液,在第14天后根据细胞增殖情况改用15%~20%FCS完全培养液。
在停用A后,残留于培养液或细胞内的A仍起一定的阻抑作用,此时需继续补加HT培养液,为杂交瘤细胞提供应急的DNA合成途径。
   (3)观察:经融合剂PEG处理后的细胞,凝集成粗颗粒状。当天用倒置显微镜观察,可见2~5个粘连骨髓瘤细胞,常有融合的巨细胞或哑铃状的细胞。一次融合成功的杂交瘤细胞生长情况大致如下:
第1~2天,各培养孔中肿瘤细胞锐减,残存的瘤细胞成黯黑或折光性差,在巨噬细胞周围聚有破碎细胞,偶见单个、数个透亮的类似骨髓瘤细胞,尚难判定是残留的瘤细胞或是早期的融合细胞。
    第3~4天,瘤细胞几乎完全消失,滋养细胞生长活跃,其中央有少数形似骨髓瘤细胞,浑圆透亮,成葡萄串状分布,少则3~5个,多则10余个,其细胞数与日俱增。
    第5~6天,小融合细胞集落继续长大,细胞透亮,可在培养板的盖板上画上克隆生长的标记。
    第7~9天,生长的细胞集落继续增大,可布满1/3或半个培养孔的面积,此时可取上清液检测相应的特异性抗体。
    4. 杂交瘤细胞的筛选 融合后的细胞在HAT培养基培养后,即有部分培养孔出现杂交瘤细胞集落,而其中仅部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。因此在培养7~10 d后用倒置显微镜观察到杂交瘤细胞长成约占1/3~1/2视野时,即可取培养上清液进行特异性抗体的检测,确定有无分泌单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)的能力,以便及时进行细胞克隆化。检测McAb的方法可根据情况进行选择。
    5. 杂交瘤细胞的克隆化 细胞融合成功后,并经证实培养孔中存在预定抗原特异性抗体时,应尽早将杂交瘤细胞克隆化,其目的是利用单个细胞培养技术,从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的细胞系,以获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞系,淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。每个杂交瘤细胞含有来自两种亲本细胞全套染色体,但在杂交瘤增殖过程中,将逐渐丢失染色体,甚而导致McAb产生能力的消失。因此,在筛选抗体阳性的杂交瘤细胞时,须尽早进行克隆化,以保持杂交瘤细胞具有同源的子代。克隆化多采用有限稀释法。
   (1)先制备小鼠饲养细胞层,将细胞悬浮与HT(融合后第一次克隆化时)或含10%FCS -1640培养液中。
   (2)用滴管将抗体阳性待克隆化细胞孔轻轻吹吸,使细胞与孔底分离,用培养液将细胞悬液稀释为每ml分别含5、10和50个细胞的悬液。
   (3)将上述稀释的细胞悬液分别加入已培养有饲养细胞的24孔培养板中,每孔0.1ml(2滴),使相应每孔分别含0.5、1或5个细胞。
   (4)将细胞培养板置于5%~7%CO2、37℃饱和湿度的温箱中培养,至第四天换培养液一次,第5~6天仔细观察各孔内细胞生长情况,并在相应的孔盖板上作标记,记录克隆生长的情况。
   (5)特异性抗体的检测:在克隆后的7~9天,在低倍镜下如见到细胞克隆布满1/3~1/2视野时,即可吸取培养上清液,用免疫学方法检测相应的抗体。如测出细胞生长孔含有特异性抗体,可选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞孔,继续同法再克隆扩大培养重复3次。如果有单克隆生长的每个孔内的上清都能检出高滴度抗体,则表明已经实现“克隆化”。
    6. 单克隆抗体腹水的制备 McAb因其具有高度特异性和能大量制备等特点,故生物试验和医药等领域得到广泛应用。将杂交瘤细胞接种与同系小鼠或裸鼠腹腔内,可诱生肿瘤和含McAb的腹水,并可有效保存杂交瘤细胞株和分离已经污染杂菌的杂交瘤细胞株。
   (1)在接种瘤细胞1~2周前,先给小鼠腹腔注射液体石蜡油或降植烷0.5ml,同批小鼠预处理后可用2个月左右。
   (2)1周后每只小鼠腹腔注射5×105~5×106杂交瘤细胞。先洗涤一次,以营养液调其浓度。
   (3)注射杂交瘤8~10天后,小鼠腹部明显胀大时,消毒小鼠腹部,用针头刺入小鼠下腹部,并轻揉其腹部,慢慢抽出腹水。一次抽5~8ml,待2~3 d后,腹水积聚,用同法反复抽,一般可抽2~3次。腹腔内产生肿瘤和腹水,抗体含量可达1 mg/ml。
    培养上清液中抗体含量低且混有大量血清蛋白,而腹水中虽然抗体含量高,但也混有蛋白,需进行纯化及鉴定其特性。

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