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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第一节 细菌形态检查法
2009-06-03 19:56  

细菌形态学是研究细菌的一个重要方面,了解细菌的形态和结构对研究细菌的生理活动、致病性和免疫性,以及鉴别细菌、诊断疾病和防治细菌性感染等均有重要的理论和实际意义。由于细菌个体微小,常以微米(μm)为测量单位,肉眼不能直接看到,必须借助显微镜放大后才能观察。根据不同的研究目的和要求,可分别选择普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。另外,由于细菌呈半透明状,要想更清楚地观察其大小和形态,需要进行染色。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。
  一、不染色标本检查法
不染色标本主要用于检查活菌的动力及运动状况。细菌未染色时无色透明,在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼,无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征鲜明的形态和运动方式,具有诊断意义。常用方法有压滴法或悬滴法,置于普通光学显微镜或暗视野显微镜下观察。
1. 压滴法 取菌液一滴,置于清洁载玻片中央,覆上盖玻片,于高倍镜下观察。制片时菌液要适量,不可有气泡,不可外溢。这是观察细菌动力的一种简便方法。
2. 悬滴法 取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块,将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林,取一个环菌液置盖玻片中央,将凹窝载玻片的凹面向下,对准于盖玻片的液滴上,然后迅速翻转玻片,用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍,不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处,无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。
3. 暗视野荧光法 由于细菌微小而且半透明,不染色时在普通显微镜下不易看清楚,如使显微镜视野变暗,使菌体发亮,则更容易观察。
  二、染色标本检查法
细菌个体微小呈半透明状,经染色后才能观察的较清楚。通过对标本染色,能观察细菌的形态、大小、排列、染色特性以及荚膜、芽孢、异染颗粒等结构,有助于细菌的初步鉴定。实验室所用的染液都是苯的衍生物,如结晶紫、美蓝、孔雀绿等,是人工合成的染料,它们带色基团与染料分子中含有的不饱和双键有关,含双键的部位的化学性质极不稳定,所以容易吸收光线而显色。而细菌的等电点比较低,一般在pH2~5之间,如果在中性、碱性或弱酸性溶液中,整个菌体带的是负电荷,容易被碱性染料染上色,这些染料对菌体的核蛋白或细胞壁的成分有特别的亲和性。常用的染色法有单染法和复染法两种:①单染法:只用一种染料染色,可观察细菌的形态、大小和排列情况,但不能用于细菌的鉴别。操作过程:涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检。 ②复染法:用两种或两种以上的染料染色,可将细菌染成不同的颜色,除可以观察细菌的形态外还能显示出细菌的特殊结构,在细菌的鉴别上有一定的意义。常用的有:
1. 革兰染色法 细菌的革兰染色是最常用的鉴别染色法,由丹麦细菌学家革兰于1884年创建,根据其染色结果将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
操作过程:涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
染色具体方法为:初染:用结晶紫,染色1分钟,水洗。媒染:加碘液覆盖1分钟后水洗。脱色:连续滴加95%乙醇,约30秒,直到滴下的乙醇无色为止,水洗。复染:加番红染色1分钟,水洗。
2. 芽孢染色
(1)原理: 细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚,致密,透性差,着色和脱色都比营养细胞困难,故一般采用一种碱性染料并在微火上加热,或延长染色时间,使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料,芽孢仍保留颜色,再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色,如此可明显区分芽孢和营养体结构。
(2)操作:
①用枯草杆菌涂片、干燥、固定。
②在涂菌处滴加5%的孔雀绿染液,用木夹夹住玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但不沸腾5~6 min。加热时应添加染料,以免蒸干。水洗。
③0.5%番红复染1分钟,水洗,烘干,镜检(芽孢绿色,菌体红色)。
3. 荚膜染色
(1)原理: 荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时,可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。
操作:
①涂片,晾干。②用Tyier氏醋酸结晶紫溶液染色2分钟,再用20%硫酸铜溶液洗涤,水洗,用滤纸吸干、干燥。③镜检:荚膜染成浅红色,细胞呈紫红色。
4. 鞭毛染色法
(1)原理: 细菌鞭毛直径为10~12nm,超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时,不仅要使鞭毛染色,还要使一部分染料堆积在鞭毛上,加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多,但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色;二是使用绝对无油的干净玻片,以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性,可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。
(2)操作:染色液配制如下。
甲液:①明矾饱和水溶液 2ml;5% 石炭酸水溶液 5ml;20%鞣酸水溶液 2ml;②碱性复红水溶液 1ml。
染色前①液与②液混合后,过滤使用。
乙液:美蓝0.1g,硼砂1g,蒸馏水溶解,定容至100ml。
染色:将制备的涂片自然干燥后,滴加甲液染色3分钟,细小流水洗去染液,用乙液复染0.5~1min,细小流水洗去染液,自然干燥。
镜检:菌体呈蓝色,鞭毛呈红色。
5. 抗酸染色法
(1)原理:分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高,主要是分枝菌酸,一般不易着色,若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色。这种针对分枝杆菌的特殊的染色法称为齐尼(Zieh-Neelsen)抗酸染色法。
(2)操作:①结核病人痰涂片,干燥、固定。②滴加数滴石炭酸复红染液,酒精灯外焰上方微微加温至冒蒸汽时,维持3~5min,勿煮沸、烧干,染液要干时随即添加。小心水洗洗净染液。③滴加3%盐酸酒精数滴,脱色半分钟至1min,水洗。④滴加碱性美兰复染0.5~1min,水洗,晾干。⑤油镜镜检:分枝杆菌呈红色,细长稍弯曲。而其他杂菌和细胞均呈蓝色。
细菌的染色尚有多种方法,如异染颗粒染色法可用于观察细菌中的异染颗粒;Fontana镀银染色法可用于螺旋体的染色检查;Giimenza染色检查立克次体等等。

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