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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第二节 免疫组织化学技术
2009-06-03 19:54  

免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)又称免疫细胞化学(immunochtochemi-stry,ICC)是指用免疫学原理,通过特异的抗原-抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。此方法可以识别定位各种细胞组织成分,如蛋白质、多肽、核酸、部分类脂、多糖、激素、病原体(寄生虫、细菌、病毒)、受体、神经介质、肿瘤的标记物(抗原或相关抗原)等,一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检查并显示出来。可以在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位,还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位定量测定。
免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
  一、免疫荧光法
    免疫荧光细胞化学是利用荧光色素标记抗体或抗原与组织切片或细胞涂片中的相应抗原或抗体反应,形成抗原或抗体与标记抗体或抗原的复合物,借助紫外光或蓝紫光激发荧光色素,并在显微镜下呈现特异性荧光反应,从而定位抗原或抗体的技术。
1.免疫荧光染色原理 免疫荧光染色是根据抗原抗体反应原理,将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,再与其相对应的抗原或抗体发生反应,从而使形成的免疫复合物带有一定量的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,检测出抗原或抗体,最终确定抗原或抗体的性质并进行定位及定量。最常用的荧光素是:①异硫氰酸荧光素(fluorescien isothiocyanate, FITC);②四乙基罗达明(tetraethylrodamine B200,RB200);③四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamine isothiocyanate,TMRITC)。
2. 染色方法 用荧光素标记抗体检查相应抗原的方法称荧光抗体法,用荧光素标记抗原检查相应抗体的方法称为荧光抗原法。这两种方法称为免疫荧光技术,以荧光抗体法较常用。免疫荧光法分为直接法、间接法、夹心法、补体法和双重染色法等。
(1)直接法:用荧光素标记的特异性抗体或抗原直接与相应抗原或抗体结合,以检查出相应的抗原或抗体成分。
操作步骤为:①冷冻切片、涂片、印片或细胞单层培养物等按不同抗原要求固定,石蜡切片按常规脱蜡至水。②用PBS(pH值7.4)充分水洗标本。③滴加相应的荧光抗体,将标本放入湿盒中,在室温或37℃染色30min,倾去作用液。④用PBS洗2次,每次5min,再用蒸馏水洗1min。⑤用50%甘油缓冲液封片,然后荧光显微镜下检查。
对照染色:可作阴性、阳性、抑制法等对照试验。
(2)间接法:此法是将荧光素标记到第二抗体上。先使第一抗体或抗原作用于组织切片与抗原或抗体反应,用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体,再与荧光素标记的抗体(第二抗体)作用。在荧光显微镜下观察,发荧光部即未知抗原或抗体所在处。此法较直接法敏感性高,操作方法较易掌握,且只需标记一种抗IgG抗体即可鉴定多种抗原。
操作步骤:冰冻切片、涂片甲醇、乙醇或丙酮固定,石蜡切片按常规处理→用PBS充分冲洗→滴入未标记的第一抗体液,将标本放入湿盒中,在37℃作用30min,倾去作用液→用0.01mol/L PBS洗2次,每次5min→滴加荧光抗体(第二抗体)液,将标本放入温盒中,在37℃作用30min,倾去作用液→用PBS洗2次,每次5min→缓冲甘油封片,荧光显微镜下检查。
对照染色:可作抗体对照、抗原对照和阳性对照试验。
(3)补体法:用特异性抗体和补体的混合液与标本上的抗原反应,补体就结合在抗原-抗体复合物上,再用抗补体的荧光抗体与补体结合,从而形成抗原抗体补体复合物-抗补体荧光抗体复合物,在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物存在处,此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。
操作步骤:标本处理与直接法相同→将适当稀释的抗体及补体等量混合滴于切片上,将标本放入湿盒中37℃作用30min→用PBS洗2次,每次5min,搅拌或振动,吹干→滴加适当稀释的抗补体荧光抗体,在37℃中染色30min→用PBS洗2次,每次5min,振动,蒸馏水洗1min→甘油缓冲液封片,荧光显微镜下检查。
对照染色:可作抗原对照、抗血清对照和灭活补体对照,将补体经56℃、30min灭活处理后,按补体同样稀释倍数与抗体等量混合,进行补体法染色结果阴性。
免疫荧光法目前多用于临床检验:①检测组织内免疫球蛋白或免疫复合物,如肾炎之肾穿刺标本、红斑狼疮之皮肤组织等;②检查血液内自身抗体,此时常用小鼠的组织标本作为抗原,滴加病人血清后,用带有荧光素的抗人免疫球蛋白抗体作间接免疫荧光法;③细胞表面抗原鉴定,适用于肿瘤细胞、淋巴细胞等,可在管内悬浮状态标记染色后转移至玻片上观察,或用流式细胞仪(FCM)进行分类、定量计数;④荧光示踪研究。
  二、免疫酶细胞化学
免疫酶细胞化学是免疫细胞化学(ICC)中最常用的方法之一,它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下,借助于酶细胞化学的手段,检测某些物质(抗原/抗体)在组织细胞内存在部位的一门新技术。
(一)染色原理
免疫细胞化学是以酶为标记物,其原理与免疫荧光法基本相似,可分为直接法、间接法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)和双PAP法等。最常用的酶是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP),其次是碱性磷酸酶(alkalinephasphotase,ALP)等。直接法是将酶直接标记在第一抗体上,间接法是将酶标记在第二抗体上,检测组织细胞内的特定抗原物质。目前的ICC染色中,以间接法为常用。
(二)染色方法
1. 直接法 
(1)其原理是用酶标记的特异性抗体或抗原直接与标本中的相应抗原或抗体反应结合,再与酶的底物作用产生有色的产物,沉积在抗原-抗体反应部位,即可对抗原或抗体进行定性、定位以及定量研究。直接法简便、快速、特异性强,非特异性背景反应低。但是必要时须用间接法作对照。
(2)染色方法:①切片按常规处理后在PBS液中洗5min。②用稀释的正常血清或10mg的牛血清(BSA)溶液处理切片20min,倾去蛋白质溶液。③滴加酶标记抗体(适当稀释)于切片上,在湿盒中,37℃孵育30~60min。④用PBS洗2次,每次5min,再用0.05mol/L Tris·HCL缓冲液洗涤5min,放在振荡器上振荡。⑤在酶的底物溶液中进行呈色反应,显微镜下观察,以结果清晰、背景无非特异性染色为度,根据供氢体不同,可分别作衬染、封固。
2. 间接法 
(1)原理:先用未标记的特异性抗体(一抗)与标本中相应抗原反应,再用抗特异性抗体的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗反应。例如第一次使用的特异性抗体是由家兔产生的,则第二次使用的酶标记抗体必须是抗免疫球蛋白抗体,常用的是羊抗兔IgG或Y-球蛋白抗体的酶标记物。可用一种酶标记抗体与多种一抗配合检查多种抗原。
(2)染色方法:①与直接法①和②相同。②滴加稀释的特异性抗体(如兔免疫血清)于标本上,4℃过夜,或在室温中30~60min。③用PBS洗涤2次,每次5min,振动。④滴加酶标记抗体(适当稀释的羊抗兔IgG HRP标记抗体)于标本上,室温孵育30min。⑤以后同直接法。
3. 酶桥法 
(1)酶桥法的原理是用化学交联法将酶与抗体分子连接,染色时在用特异性抗体与标本中抗原结合之后,将桥抗体结合于其上,再将抗酶抗体结合于桥抗体上,最后把酶结合在抗酶抗体上,经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。例如:特异性抗体和酶抗体都是兔产生的,再用羊抗兔IgG作为桥抗体就可连接起来。
(2)染色方法:①组织切片脱蜡至水,用PBS洗3次。②过氧化氢-甲醇(30%H2O21ml加甲醇100ml)在室温中处理切片5~30min。③充分水洗后,入PBS洗2次,每次5min。④用20倍稀释的正常血清(产生二抗的动物血清)在室温下反应30min。⑤用PBS洗2次,每次5min。⑥加入第一抗体(用兔产生的),在4℃下反应16~24h。⑦用PBS洗2次,每次5min。⑧加入第二抗体(羊抗兔IgG血清),在室温下反应30min至1h,用PBS洗2次,每次5min。⑨加入兔抗酶抗体在室温下反应30min至1h,用PBS洗2次,每次5min。⑩用过氧化物酶溶液(70~100μg/ml,PBS溶解)在室温中作用30min,PBS充分洗净。{11}在DAB-H2O2液中进行呈色反应5~30min,充分水洗。{12}可用苏木素液淡染细胞核。{13}乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
4. 过氧化物酶抗过氧化物法(PAP)
(1)过氧化物酶法的原理:PAP法的基本原理与酶桥法相同,只是酶和抗体制成的免疫复合物(PAP)代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶,把两个步骤合并为一个步骤,其效果更好。PAP是一种复合物,不存在游离的免疫球蛋白,不会引起非特异性染色。
(2)染色方法:①石蜡切片经二甲苯脱蜡,经下行各级乙醇水化;冰冻切片置空气干燥,丙酮固定20~30min;载有培养细胞的盖片或细胞涂片经戊二醛、乙醇或多聚甲醛固定5min。②切片经PBS冲洗3次,每次5min。③用甲醇加0.3% H2O2(现用现配)。处理切片30min(室温),以封闭内源性过氧化物酶。④用PBS冲洗3次,每次5min。⑤加入1∶20的正常羊血清室温孵育30min,以封闭非特异性结合位点。⑥用滤纸吸去羊血清(勿干)。⑦滴加稀释一抗,湿盒内4℃孵育过夜。⑧用PBS冲洗3次,每次5min。⑨滴加二抗,湿盒内孵育45~60min。⑩用PBS冲洗3次,每次5min。{11}滴加PAP复合物,湿盒内37℃孵育45~60min。{12}用PBS冲洗3次,每次5min。{13}DAB-H2O2液显色5~30min。显色可以滴染或浸染,随时镜检,至显色满意时用PBS中止显色。必要时用苏木精复染细胞核。{14}脱水,透明,封固。
对照:可作空白、替代(第一抗体和桥抗体)及吸收试验。
  三、免疫金-银细胞化学
1971年,由Faulk和Taylor创立的免疫金染色方法使胶体金技术作为标记物首次应用于免疫组化研究,此法是用胶体金标记抗体在透射电镜下定位细菌表面抗原,获得了较好效果。Holgate等于1983年将免疫金法与银显影方法相结合,创造了一种灵敏度更高的免疫金-银染色法,这种方法还可用于核酸的原位杂交研究,使得胶体金标记技术在免疫电镜和免疫光镜的应用范围更大,是目前一种新的免疫细胞化学技术。
(一)免疫金-银染色原理 
免疫金-银染色方法(IGSS)的原理与间接法相似,先将特异性抗体与抗原反应,随后用金标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合,如果用直径为20nm以上的胶体金作为标记物,应可见红色产物,此法为免疫金染色法(IGS)。为了经济方便,Holgate等将其改进为IGSS法,即经过银显影液增强,使金颗粒周围吸附大量银颗粒,在光镜下就可看到阳性反应部位呈金属银的黑褐色,从而提高了灵敏性。此法实用性强,用于常规的石蜡切片,并可避免使用具有致癌性的物质。
(二)各种方法的具体操作
1. 冰冻切片IGSS染色法 在制作冰冻切片的组织中,应根据抗原性保存的要求,可先经固定液灌注或浸泡,也可先制作冰冻切片,然后再固定。固定过的组织可用20%蔗糖浸泡过夜,以减少冰冻切片中冰晶的形成。染色同石蜡切片步骤。
2. 石蜡切片的IGSS染色法 以羊抗兔IgG金标记抗体为间接抗体的一般程序如下。
(1)切片常规脱蜡至水。
(2)经含汞固定液固定的组织切片须经0.5%碘乙醇10min脱汞,然后0.5% Na2S2O3水溶液脱碘,再用流水冲洗,蒸馏水洗后入0.05%mol/L Tris缓冲生理盐水(pH7.4),不含汞的切片可直接进入TBS中洗涤2次,每次5min。
(3)抗原性减弱的切片,可用0.1%胰酶在37℃消化5~30min,抗原性强的切片可直接进入下一步。
(4)正常羊血清(1∶5或1∶10)作用10min,吸去,不洗涤。
(5)加适当稀释的特异性抗体(兔产生),在室温中作用1~2h,或4℃下20h。
(6)用0.05%mol/L TBS(pH7.4)洗3次,各10min。
(7)用0.02mol/L TBS(pH8.2)洗10min。
(8)正常羊血清(1∶5)作用10min,吸去,不洗涤。
(9)加稀释的羊抗兔IgG金标记抗体,室温下作用1h,或4℃过夜。
(10)用0.02%mol/L TBS(pH8.2)洗10min。
(11)用0.05%mol/L TBS(pH7.4)洗3次,各10min。
(12)双蒸馏水洗5min。
(13)入银显影液3~5min(水剂),或20~40min(阿拉伯胶液),反应过程避光。
(14)蒸馏水洗多次后衬染。
(15)脱水、透明和封固。
如用金标记葡萄球菌A蛋白代替金标记间接抗体,须将正常羊血清处理,换成1%卵白蛋白。所用pH值为8.2的TBS(0.02mol/L)均改用pH值为7.4的。
3. 半薄切片的IGSS染色法 染色的半薄切片,可以在光镜下直接观察阳性结果,为电镜取阳性部位及观察打下良好基础。步骤如下:
(1)脱环氧树脂。切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30~60min,然后以无水乙醇洗2次,每次5min,再以95%、80%、70%乙醇各洗5min,然后水洗。
(2)经锇酸固定过的切片入1%过碘酸10min,除去锇酸,然后蒸馏水洗5min,4次。
(3)切片用0.05mol/L TBS,pH7.4洗10min。
(4)按石蜡切片步骤(4)以后进行IGSS染色。
(三)试剂配制
1. 0.05mol/L TBS(pH7.4)液 Tris(三羟甲基氨基甲烷)12.1g,NaCl 17.5g,双蒸水1500ml。在搅拌下加入浓HCl至pH7.4,加蒸馏水至2000ml。
2. 0.02mol/L TBS(pH8.2)液 Tris 4.84g,NaCl 17.5g,BSA 2.0g,NaN3 1.0g。加双蒸水1500ml,在搅拌下,用浓HCl滴入,调pH值至8.2,加双蒸水至2000ml。
3. 银显影液的配制
(1)乳酸银显影液的配制:10%阿拉伯胶水溶液或1%明胶60ml,pH3.5柠檬酸缓冲液10ml。搅拌均匀,加入对苯二酚水溶液(含0.85g)15ml,临用前加入乳酸银水溶液(110mg/5ml,注意避光)。
(2)硝酸银显影液的配制:10%阿拉伯胶水溶液或1%明胶60ml,pH3.5柠檬酸缓冲液10ml,含1.7g对苯二酚的水溶液30ml。上述3种溶液混合均匀,临用前加入含40mg的硝酸银水溶液2ml,注意避光。其中pH3.5柠檬酸缓冲液配制方法为枸橼酸25.5g,枸橼酸三钠23.5g,加双蒸水100ml溶解。
对于上述两种显影液中所用25%阿拉伯胶可用双蒸水代替,此时反应明显加快,可缩短至3~5min,要在光镜下密切观察。
  四、亲和免疫细胞化学
在组织学研究中,利用两种物质之间的高度亲和能力及其可标记性,以显示其中一种物质的方式称亲和组织(细胞)化学。这些亲和物质如葡萄球菌A蛋白(SPA)与免疫球蛋白(IgG)、生物素与卵白素、植物凝集素与糖分子、受体与配体、酶、同位素等都可作为标记物而与之结合。在实际应用中,亲和组织化学常与免疫组织化学相结合,即为亲和免疫组织(细胞)化学。
(一)抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(Avidin Biotin-Peroxidase Complex technique,简称ABC技术)
1. 基本原理 ABC法是在BRAB法和LAB法的基础上改良的,其特点是利用抗生素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。与LAB法和BRAB法不同的是第一抗体不为标记物所标记,生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接。复合物是将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素—过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的,最后进行显色反应定位。
2. ABC法操作步骤 ①冰冻切片或石蜡切片均可。②冰冻切片可用丙酮固定10min左右,0.01mol/L PBS(pH7.2~7.6)洗5min,更换3次。石蜡切片需经脱蜡、系列乙醇至水。③第一抗体,室温孵育15min。④PBS洗5min,更换3次。⑤加生物素标记的第二抗体(1∶200左右),37℃孵育15min。⑥PBS洗5min,更换3次。⑦加1∶100ABC复合物37℃作用45min。⑧PBS洗5min,更换3次。⑨用0.05% DAB 0.03% H2O2液显色。⑩复染,封片、观察。
3. ABC法的优点 ①敏感性高:ABC法与PAP比较高20~40倍,这是因为生物素与抗生物素间有极强的结合力。②特异性强,背景染色淡,减少了非特异性染色。③方法简便,节约时间。操作的抗原抗体反应的时间可由PAP法所需的数天缩短为2h。④由于生物素与抗生物素具有多种示踪物结合的能力,可用于双重或多重免疫染色。
(二)桥抗生物素-生物素技术(Bridged Avidin-Biotin technique,简称BRAB技术)
BRAB技术是用生物素分别标记抗体和酶,然后以抗生物素为桥,把两者连接起来。检查抗原时,先用生物素标记的抗体与细胞(或组织内)的抗原反应,洗去未结合的抗体,加入抗生物素孵育后,洗去未结合的抗生物素,再加入已标记酶的生物素孵育,洗片,以细胞化学方法呈色反应。
(三)标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-Biotin technique,LAB技术)
LAB技术是以生物素标记抗体作第一抗体,酶标记抗生物素作为第二抗体。操作步骤:①切片在含有1∶100生物素标记第一抗体(PBS液稀释)孵育1h,室温。②PBS洗2次,每次5min。③用1∶200过氧化物酶标记的抗生物素液孵育45min,水洗。④酶呈色反应。
BRAB法和LAB法都须以生物素标记第一抗体,应用不如ABC法普遍。  
  五、非特异性染色及染色对照
(一)非特异性染色及其消除方法
在进行免疫组织化学染色时,组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性染色,其来源主要有以下几个方面:
1. 内源性过氧化物酶 内源性过氧化物酶主要存在于红细胞和粒细胞,固定不好是内源性过氧化物酶的另一来源。
2. 第一抗体 制备第一抗体的抗原纯度不高,其杂蛋白产生的非特异抗体会吸附到组织细胞上造成非特异性染色。其去除的方法:一是尽可能高地稀释抗体,减低非特异性抗体的浓度;二是一抗孵育之后用PBS充分冲洗,因非特异抗体结合不牢,冲洗能使其解离;三是在滴加抗体之前,滴加正常血清,以封闭非特异结合位点。
3. 第二抗体 将IgG从血清中分离出来时同时存在四种成分,除特异性抗IgG外,其他成分可以通过与组织结构的特异性交叉反应或通过非特异的疏水键与组织或细胞结合,产生非特异性染色。去除方法基本同上。
4. 自发荧光 主要指经固定后组织产生的自发荧光,用硼氢化钠(NaBh4)处理切片10min可消除。
(二)染色对照
进行免疫组织化学染色时,必须证实组织内显示的荧光或有色产物确实是抗原与相应的特异性抗体结合所产生的。影响免疫组织化学染色的因素很多,因此,设严格的对照才能对染色结果作出正确的评价。常用的染色对照有:
1. 阳性对照 用已知抗原的组织切片与待检标本同样处理,染色结果应为阳性,称阳性对照。
2. 阴性对照 用已知不存在的相应抗原的组织标本染色,结果应为阴性。
3. 空白对照 用缓冲液替代第一抗体是最常用的空白对照,染色结果应为阴性。
4. 替代对照 用产生第一抗体动物的免疫前血清来替代第一抗体,染色结果应为阴性。这可证明待检组织切片的阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致,而是该抗体与组织内抗原特异性反应的结果。
5. 其他 另外还有吸收试验及抑制试验等。
  六、抗原的修复
抗原修复(antigen retrieval)是指通过化学或物理方法暴露抗原决定簇,使抗原恢复原有的空间结构。抗原修复一般分为两类:化学修复法和热修复法。
(一)化学修复法
化学修复法主要借助酶消化来实现,蛋白酶消化可以去除抗原决定簇表面上的杂蛋白,最主要的是打开因甲醛固定而引起的交联,从而起到暴露抗原决定簇的作用,使第一抗体和抗原充分结合。
1. 胰蛋白酶 一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为10~40min(37℃),主要用于细胞内抗原的显示。
2. 胃蛋白酶 一般使用浓度为0.4%,消化时间为30~180min(37℃),主要用于细胞间质抗原的显示。
(二)热修复法
热修复法是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复,常用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好。
1. 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法 切片脱蜡至水后,3% H2O2处理10min,蒸馏水洗3次,每次2min。将切片插入塑料架上,将盛缓冲液的容器置微波炉内加热使温度到96℃(大约1~2min),再将切片放入缓冲液中,20min(96℃)后取出容器,自然冷却至室温。
2. 石蜡切片高压抗原修复操作方法 切片脱蜡至水,将一定量的缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅不压阀。当压力锅开始慢慢喷汽时计5min,压阀加压10min,然后将压力锅断电,冷水冲至室温后,取出切片,再用PBS冲洗。
3. 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法 切片脱蜡至水后,放入盛有缓冲液的容器中,并将此容器置于盛有足够自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,水温使标本达到95℃起开始计时20min,然后端离电炉,冷却至室温,蒸馏水、PBS冲洗。

        思 考 题

1.为什么要进行组织固定?常用的固定液有几种?
2.取材分几类?有哪些注意事项?
3.常用的脱水剂有哪几种?应如何选择?常用透明剂的优缺点是什么?
4.浸蜡时间应怎样选择?常用的包埋法有哪些?
5.怎样切好石蜡片?
6.苏木精-伊红染色原理是什么?步骤有哪些?
7.怎样掌握染色与分化?
8.免疫组织化学的基本原理是什么?
9.试述PAP法和ABC法的染色原理和染色方法。

                                  (朱辛为)  

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