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第六章 实验报告与论文的撰写
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第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
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第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第二节 流式细胞术的样品制备
2009-06-02 13:43  

(一)不同来源样品的处理

1. 培养细胞

1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。

2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%~70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。

2. 新鲜标本

1)将标本切成1~2mm3的小块。

2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10~30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。

3)300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5min,获得已消化的细胞。

3. 石蜡包埋标本

1)标本在切片机上切取3~5片50μm厚的组织片。

2)将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。

3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min,每隔10min振动1次。

4)300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300g离心5min。

注意:脱蜡一定要完全(若加入100%乙醇无絮状物飘起即可);切片厚薄适宜,太薄碎片多,影响FCM分析结果,太厚易造成脱蜡不净;注意掌握消化时间,避免已释放的细胞被消化。

(二)直接免疫荧光标记的样品制备

用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色,然后用流式细胞仪检测,阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下:

1. 每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。

2. 一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗,另一份加入荧光标记的无关单抗,作为同型对照样品。

3. 室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行),一般在室温下反应15~30min即可。

4. 加入500μl PBS重悬成单细胞悬液即可上机检测。

(三)间接免疫荧光标记的样品制备

1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30min。

2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800~1000rpm,5min)。

3.用100μl PBS重悬细胞,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30min。

4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重悬成单细胞悬液,上机检测。

注意:以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间,一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明,应先进行预实验,掌握好剂量与最佳反应时间后,再进行流式样品的制备。制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%~4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。

(四)DNA荧光染色的样品制备

DNA是细胞内含量比较恒定的参量,随着细胞增殖周期的各时相而发生变化。荧光染料(如PI)可选择性地定量嵌入核酸(DNA/RNA)的双螺旋碱基之间,与细胞特异性结合,DNA含量与荧光染料的结合量成正比,因此通过测定荧光强度可获知细胞的增殖情况。

1. 将固定过的细胞离心(500~1000rpm,5min)弃上清液,再用PBS洗涤2次。

2. 用PBS调整细胞浓度,每份为1×106个细胞/100μl。

3. 加入1000μl DNA 荧光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色试剂盒),室温下避光染色15 min。

4. 上流式细胞仪检测。

以上样品的制备可分析细胞周期各时相的百分比,同时可粗略观察有无凋亡细胞现象,如果用对照液(鸡红细胞)作参照标准,可进行细胞DNA倍体分析,通过DNA指数(DNA index,DI)衡量DNA的相对含量,DI可用下式计算:

DI=样品G0/G1期的均值/正常二倍体细胞G0/G1期均值

(五)细胞凋亡检测样品的制备

根据实验方案诱导细胞凋亡,制备单细胞悬液,使用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒,通过Annexin V抗体与磷脂丝氨酸(PS)的特异性结合来检测细胞凋亡的情况。 

1. 将10×的结合缓冲液用蒸馏水稀释成为1×,冰育。

2. 悬浮细胞在低温环境中,用PBS洗涤细胞2次(800~1000rpm离心,5min)。

3. 弃上清,加入490μl预冷的结合缓冲液重悬细胞(细胞浓度为105~106/ml)。

4. 加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI于细胞悬浮液中,轻轻混匀。

5. 将试管置于冰上,避光孵育10分钟。

6. 上FCM检测。

(六)微量全血法免疫荧光标记的样品制备

目前制备全血细胞样品的方法很多,且很成熟,常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,然后进行特异性荧光染色,其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的Q-PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法。

1. 微量全血直接荧光染色法

1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份),置12×75mm专用塑料试管中。

2)每份加入20μl特异性荧光单抗,另一份加入荧光标记的无关单抗作同型对照,室温下避光染色15min。

3)置 Q-PREP 仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞,静置5min。

4)上流式细胞仪检测。

2. 微量全血间接荧光染色法

1)取肝素或EDTA抗凝全血(100μl/份),置12×75mm专用塑料试管中。

2)加入50μl特异的单克隆抗体(一抗),室温下孵育30min。

3)置Q-PREP仪上溶解红细胞,稳定和固定白细胞。

4)离心(800~1000rpm,5min)弃上清液,用PBS洗涤细胞2次。

5)加入50μl荧光(FITC或PE)标记的第二抗体,室温下避光染色30min。

6)上流式细胞仪检测。

3. 注意事项

1)新鲜全血一般室温下放置8小时以内可以使用,时间过长会使活性降低,影响测定结果。

2)抗凝血应保证无血块凝集。

3)全血加入试管中时,应尽量避免加到试管壁上,如沾到了管壁上必须用用棉签擦净,否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。

(七)样品制备应注意的问题和影响因素

1. 样品制备应注意的问题

1)单细胞悬液的制备是流式细胞术分析的关键。如遇有细胞团块应先用300~500目的细胞筛网过滤后,再上机检测。    

2)标本采集后要及时固定或深低温保存,手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,要避免出血与坏死组织。

3)免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除,要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应<2%,尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时,否则这些细胞的非特异性荧光增加,会干扰免疫荧光测定。

4)细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度,一般每份样品要求的细胞数为5×105/ml~1×106/ml,对肿瘤细胞DNA异倍体的样品分析,至少应有20%的肿瘤细胞存在(占主峰1/5以上的异倍体才可确认为异倍体峰)。

 (5)石蜡包埋组织单细胞制备时要注意:选取含待测细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜,最好为40~50μm;彻底脱蜡,以免残留的石蜡影响酶的消化活性;充分水化,使组织还原到与新鲜组织相似的状态。

2. 影响样品制备的因素

1)温度对荧光强度的影响:一般认为,温度升高时荧光减弱,所以在荧光测量时要保持染色后的样品在适当低温环境下进行,并尽可能减少样品的光照射时间。有条件时,应使样品观察室做到恒温装备,使温度对荧光染色的影响减少到最小,会得到更好的荧光定量测定的结果。

2)pH值对荧光强度的影响:每一种荧光染料分子发光的最高量子产额,都有自己最适合的pH值,以保持荧光燃料分子与溶剂间的电离平衡,如果pH值发生改变,可能造成荧光光谱的改变,如FITC在酸性溶剂中呈蓝色荧光,为阳离子发光;在碱性溶剂中呈黄绿色荧光,为阴离子发光。

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