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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第三节 共聚焦荧光探针标记方法
2009-06-02 13:48  

(一)BCECF测定pH值

1. 储存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入BCECF-AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(二)SNARF-1定量比率测定pH值

1. 储存液配制 SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入SNARF-1-AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(三)Indo-1测定细胞内Ca2+

1. 储存液配制 Indo-1(分子量为840),活细胞标记常选用Indo-1 AM,分子量为1010,呈干粉状,将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,避光冷藏保存。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入Indo-1 AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。用PBS(含Ca22+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

也可用弱的去垢剂Pluronic F-127助染。可将Pluronic F-127溶于DMSO配成20%(W/V)的溶液,终浓度1%~2%。

(四)Fluo-3测定细胞内Ca2+

1. 储存液配制 Fluo-3(分子量为855),活细胞标记常选用Fluo-3 AM,分子量为1130,呈橙色粉状,避光冷藏保存或将其溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,避光冷藏。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入Fluo-3 AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

可用Pluronic F-127助染。方法同上。

(五)CFDA测定细胞间通讯

1.储存液配制 CFDA即5-(6)-羧基荧光黄乙酰乙酸盐(5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate ,5(6)-CFDA),分子量为460.40,用乙醇或DMSO配成10mg/ml溶液,等份分装后,避光冷藏。

2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入CFDA溶液(终浓度10-20ug/ml),37℃孵育10~15min。用PBS(含Ca2++、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(六)DiBAC4测定细胞膜电位染色步骤

1. 培养细胞用DiBAC4孵育,37℃,10~20min,终浓度2~5μmol/L。

2. 激光扫描共聚焦显微镜观察,实验中注意将细胞内外的DiBAC4浓度保持一致。如果细胞去极化,如增加溶液的KCl浓度10~15μmol/L,DiBAC4荧光强度增强。

(七)Rhodamine 123标记活细胞线粒体染色步骤

培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍加入Rhodamine 123溶液(终浓度1μg/ml),37℃孵育10~30min用PBS冲洗2遍激光扫描共聚焦显微镜观察。

(八)AO显示RNA和DNA染色步骤

培养细胞用95%酒精固定10~15min,干燥。1%醋酸酸化30s。0.01%AO染色5~10min。PBS(pH 4.8)洗1min。0.1mol/L CaCl2分化30s或用水洗数分钟。激光扫描共聚焦显微镜观察。

(九)PI显示DNA染色步骤

培养细胞用PBS洗2遍,离心。弃上清液留0.5ml,用PBS将细胞密度调整为1×106/ml。加入浓度为5mg/50ml的 RNAase  0.5ml, 37℃消化30min。取出放入冰浴中,加入浓度为5mg/100ml的PI  1.5ml , 染色至少30min。300目尼龙网过滤。共聚焦显微镜观察。

思 考 题

1. 试述激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及主要功能。

2. 如何选择共聚焦激光扫描显微镜的荧光探针?

3. 设计一个用Fluo-3测定细胞内Ca2+的实验程序。

 

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