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第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第五节 大鼠海马神经细胞钠通道电流的记录
2009-06-02 13:53  

【实验目的】

1. 了解膜片钳技术的基本原理及记录方法。

2. 观察记录大鼠海马神经细胞单通道钠电流及全细胞钠通道电流。

【实验原理】

钠通道在多种细胞尤其是在神经、肌肉等可兴奋细胞中广泛存在。钠电流(ⅠNa)是快反应细胞上最重要的除极离子流,与细胞的兴奋性密切相关。钠通道在膜电位-70~-65 mV开始激活,产生一迅速激活并迅速失活的内向电流,最大电流峰值在膜电位-40 ~-30 mV,反转电位为+30 mV左右。在参数设计上应使膜电位钳制在-80 mV以下,此时给予不同程度的去极化阶跃电压,则可得到钠电流,由于钠通道激活和失活均很快,属于快通道,因此,刺激脉冲波宽常为20~50 ms。当静息膜电位升至-50 mV左右,可使Na+通道完全失活,不能引起钠通道开放。为证实所测电流为钠电流,常借助于工具药,如细胞外液中河豚毒(TTX)或Ⅰ类抗心律失常药来选择性阻断钠通道。

【实验对象】

成年大鼠。

【试剂与器材】

1. 器材 膜片钳放大器、微电极拉制器、倒置显微镜、三维操纵器、电极抛光仪、玻璃微电极、恒温水浴箱、切片机、哺乳类动物手术器械、氧气瓶。

2. 试剂和药品 胰蛋白酶和河豚毒为美国Sigma公司产品、人工脑脊液、电极内液、普罗帕酮。 ①人工脑脊液成分(mmol/L):NaCl  124,KCl 3.3,NaH2PO4 1.2, NaHCO3 26,CaCl2 1,MgSO4 5,HEPES 10,Glucose 10,TEA 10, 4-AP 1 ,pH 7.2~7.4。②电极内液成分(mmol/L):CsF 140, EGTA 10, HEPES 10,TEA 10, pH 7.2~7.4。

【实验方法与步骤】

1. 海马神经细胞的急性分离方法

将大鼠以20%乌拉坦1g/kg(5ml/kg)麻醉后断头,立即取出脑组织并迅速置入低温人工脑脊液(0℃~4℃)中10~20s,然后于大脑半球腹内侧分离出海马,将海马切成400μm的薄片,置于人工脑脊液内孵育30 min后,更换为含1g/L胰蛋白酶的人工脑脊液酶解40min。用人工脑脊液冲洗脑片3次后,再将脑片置于人工脑脊液内孵育待用,上述孵育和酶解过程中,溶液需保持在32℃并连续通以5%CO2+95%O2混合气。最后,将部分脑片移入盛有氧饱和的人工脑脊液的离心管内,先后用尖端经热处理的直径为400μm和150μm左右的吸管轻轻吹打,直至单个海马神经元分离;取上部细胞悬液,加入培养皿内,约20min后细胞贴壁,即可在倒置显微镜下观察细胞形态,并进行膜片钳记录。

2. 玻璃微电极的制作

用微电极拉制器将玻璃毛细管分两步拉制成尖端直径约为 lμm的微电极;为了提高封接的成功率,可将微电极尖端在显微镜下接近抛光仪的热源进行抛光。然后用注射针从电极尾部充灌电极内液到微电极中备用。

3. 仪器的连接  (见图22-13)

4. 高阻抗封接的形成

将分离的大鼠海马单个细胞置于倒置显微镜的浴槽中,待细胞贴壁后,在三维液压操纵器推进下,使内充电极内液的微电极尖端进入浴液。由膜片钳放大器向微电极发放一电压为 10mV、波宽为40 ms的方波脉冲信号,观察封接形成过程。当微电极尖端与细胞表面接触后,可见应答电流减小,再向微电极尖端施以负压,使应答电流进一步减小至零,则形成G欧姆封接。

5. 大鼠海马神经细胞单通道钠电流的记录

在微电极与细胞膜封接电阻达到G欧姆级后,即形成细胞贴附式记录模式,此时,如给予膜片一个保持电位-120 mV、指令电位-50 mV的刺激,即可以记录到海马神经细胞的单通道电流(图22-14)。

6. 大鼠海马神经细胞全细胞钠电流的记录

在记录到单通道电流后,可经微电极给予负压吸引或电脉冲击破电极尖端的膜片,使电极内液与细胞内液相通,则形成了全细胞记录模式,调节快电容补偿,抵消电容性尖峰,调节放大器的慢电容补偿和串联电阻补偿来抵消瞬态电流。在电压钳制模式下,给细胞以如下参数刺激:保持电位为-120 mV,指令电压-90~-25 mV,脉冲阶跃为 10 mV,刺激频率为 0.5 Hz,持续时间为 40 ms,即可引导出全细胞钠通道电流(图22-14)。如在浴液中给予河豚毒(TTX) 50μmol/L或给予I类抗心律失常药普罗帕酮 20 μmol/L,灌流 10 min后,再给细胞以上述刺激,可观察到钠电流幅度的变化。

【注意事项】

1. 在分离细胞时,注意调整胰蛋白酶用量和消化时间,防止过度消化造成细胞损害。

2. 选择贴壁良好、立体感强、折光性好、表面光滑的细胞进行实验。  

3. 微电极尖端抛光,将有利高阻抗封接的形成并提高实验成功率。

  思 考 题

1. 何谓膜片钳技术?其基本原理如何?

2. 全细胞记录钠电流的参数是如何设置的?  

 

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