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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第五节 肝脏药物代谢酶CYP450含量测定
2009-06-02 13:58  

【实验目的】

测定药物对肝脏CYP450药物代谢酶的诱导和抑制作用。

【实验原理】

药物的体内代谢过程可分为I相反应(分解代谢)及II相反应(合成代谢)。I相反应包括氧化、还原和水解反应,主要由细胞色素P450(CYP450)酶催化。CYP450酶主要分布在肝脏,故又称作肝药酶。CYP450酶的诱导和抑制具有重要的临床意义,可导致临床上的药物相互作用。苯巴比妥钠为CYP450酶的诱导剂,而放线菌素D为CYP450酶的抑制剂。本实验通过测定苯巴比妥钠和放线菌素D对肝脏CYP450酶含量的影响,介绍了肝药酶诱导剂及抑制剂的筛选方法之一。

CYP450酶含量的测定:CYP450为血红素蛋白,其还原型与CO结合后,在波长450nm处出现吸收峰,故可通过测定溶液的吸光度值,反映溶液中CYP450酶的含量。

【实验对象】

小鼠(昆明种),雌雄各半。

【试剂与器材】

0.75%苯巴比妥钠溶液,0.002%放线菌素D溶液,0.25mol/L蔗糖溶液,Tris-HCl缓冲液,连二亚硫酸钠,生理盐水,分光光度计,天平,低温离心机,制冰机,CO气瓶,玻璃匀浆器,漏斗,移液管,冰盒。

【实验方法与步骤】

1. 分组 先将小鼠逐一称重,按照体重由小到大(或由大到小)排序。根据简化随机原则将小鼠分为3组(甲、乙、丙),每组3只。

2. 腹腔注射给药 甲组为0.75%苯巴比妥钠溶液,乙组为0.002%放线菌素D溶液,丙组为生理盐水。每组小鼠均连续给药3天。

3. 制备肝匀浆 小鼠处死,取出肝脏,注意勿破坏胆囊。称重后,将肝组织置于玻璃匀浆器中,加入预冷后的0.25mol/L蔗糖液(0.5ml/100mg肝组织),冰浴下研磨至淡粉色匀浆。然后4摄氏度下10,000 g离心20 min后,留取上清液。

4. CYP450酶含量的测定 取离心后上清液1ml,加入预冷后的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液9ml,充分混匀。冰浴下通CO气,1~2气泡/s,通气2min。将通气完毕的溶液分为两半,分别置于两个试管中:其一作为测定吸光度时的参照杯,另一加入连二亚硫酸钠5mg,充分混匀,即为待测样品杯。测定并记录样品杯在450nm和490nm波长下的吸光度值(表23-4)。

    5. 计算CYP450酶含量

根据公式A = E·C·L,其中

A:吸光度

E:490nm到450nm波长的示差光谱消光系数,本实验中E = 104L/cm·mmol

C:CYP450浓度

L:比色杯厚度(光路长度),本实验中比色杯为1cm

因此,得到CYP450(nmol/g肝脏)= [(A450 - A490) / E·L]×50000

6. CYP450酶的诱导和抑制

1) CYP P450升高百分率:

[(苯巴比妥组-生理盐水对照组) /生理盐水对照组]×100%

2) CYP P450降低百分率:

[(生理盐水对照组-放线菌素D组) /生理盐水对照组]×100%

【注意事项】

1. 本实验制备肝匀浆过程均需于冰上操作完成,所使用的溶液均需预先置于冰中预冷,以避免操作过程中造成的CYP450酶损失和破坏。

2. 取出肝脏过程中,注意不要破坏胆囊,以避免胆红素对CYP450血红素蛋白测定的影响和干扰。

3. CYP450(nmol/g肝脏)= [(A450 - A490) / E·L]×50000的计算公式,其中50000为本实验制备肝匀浆过程中的稀释倍数。

4. 测定肝匀浆中CYP450酶含量为简单、粗略的测定方法。肝脏CYP450酶主要存在于肝细胞的滑面内质网上,故可采用超速离心法提取肝微粒体后,测定肝微粒体的CYP450含量。提取肝微粒体后亦可进一步与CYP450酶底物探药共孵育,从而测定CYP450酶对底物药物的代谢活性。提取肝微粒体方法简述如下:将肝匀浆离心后得到的上清液,4°C下105, 000 g离心60 min,留取离心后的沉淀,加入肝微粒体重悬液(0.25 M蔗糖-0.1 M磷酸钾缓冲液,1 mM EDTA,pH 7.4,1 ml/g肝脏)重悬,-80°C储存待用。

5. 本实验中CYP450酶含量的单位为nmol/g肝脏。若提取肝微粒体后,可通过测定肝微粒体的蛋白浓度(如Bradford法),求得单位蛋白浓度的CYP450酶含量。

  思 考 题

1. 请举例说明CYP450酶的诱导或抑制具有哪些临床意义?

2. 试述CYP450诱导剂及抑制剂的可能作用机制?

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