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第一章 绪论
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第三章 文献综述及文献检索
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第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
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第十二章 组织细胞培养技术
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第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第一节 蛋白质提取
2009-06-02 14:03  

蛋白质的提取工作是将经过处理或破碎的细胞,置于一定的条件和溶液中,让被提取物充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关,一般遵守“相似相溶”的原则。扩散作用对蛋白质的提取有一定的影响。减小溶剂的黏度、搅拌和延长提取时间可以提高扩散速度,增加提取效果,提取的原则是“少量多次”,即对于等量的提取溶液,分多次提取比一次提取效果好得多。大部分蛋白质都可以溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中,因此,可采取不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。

一、水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质的稳定性好,溶解度大,是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1~5倍,提取时需要均匀地搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度视其有效成分的性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此基于这一点考虑,提取蛋白质时一般采用低温(5℃以下)操作。

为了避免蛋白质提取过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸、碘乙酸等)。

下面着重讨论提取液的 pH 和盐浓度的选择。

1. pH 蛋白质是具有等电点的两性电解质,提取液的 pH 应选择在偏离等电点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或者过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆化。一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。

2. 盐浓度 稀盐溶液可促进蛋白质的溶解,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02~0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。

二、有机溶剂提取法

一些和脂类结合比较牢固或者分子中非极性侧链较多的蛋白质,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂,它们具有一定的亲水性,还有较强的亲脂性,是理想的提取脂蛋白的提取液,但必须要在低温下操作。

丁醇提取法对提取一些与脂类结合紧密的蛋白质特别优越,一方面是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;另一方面,丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起蛋白质的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。

三、蛋白质提取举例——胰糜蛋白酶的制备

【实验目的】

掌握从组织中制备胰糜蛋白酶的原理和方法。

【实验原理】

胰糜蛋白酶是胰腺产生的一种消化酶。最初以酶原的形式被合成与分泌,之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一种催化肽键的肽链内切酶,主要切断色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基侧肽键。

酶绝大多数都是蛋白质,因此一般提纯蛋白质的方法也适用于酶的提纯,所不同的是在提纯酶的过程中要不断地进行酶活力的检测,本实验主要涉及提取过程。

【实验药品与器材】

(一)材料和试剂

1. 主要材料:新鲜猪胰脏1个。

2. 主要试剂:

2.5mol/L H2SO4溶液,固体(NH4)2SO4,氯化钙粉,10%三氯乙酸溶液,1%酪蛋白溶液,)0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液,1%BaCl2溶液,5mol/L NaOH溶液。

(二)主要器材

组织捣碎机、手术器械、纱布、漏斗、透析袋、离心机、烧杯、pH计、离心管。

【实验方法与步骤】

1. 提取 取新鲜猪胰脏,放在盛有冰冷2.5mol/L H2SO4溶液的容器中,保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后,称重。用组织捣碎机粉碎。然后混悬于两倍体积的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中,置于冰箱中过夜。将上述混悬液以3000rpm离心10min,上层液经两层纱布过滤至烧杯中;将沉淀再混悬于等体积的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中,再离心,将两次上层液合并,即为提取液。此时可留样测酶的活力。

2. 分离。

3. 结晶 取分离所得的胰糜蛋白酶溶于3倍体积的水中(此时可取0.5ml留样测酶活力),加(NH4)2SO4(1.44g/10ml),用5mol/L NaOH溶液调pH至6.0,在室温放置12h即可出现结晶,在显微镜下观察结晶形状。

【注意事项】

1. 整个操作过程在0℃~5℃条件下进行。

2. 实验材料应采用新鲜胰组织。

3. 分清实验过程中每次离心后各保留的是上清液,还是沉淀。

4. 离子强度、pH、温度、试管的洁净度等均可影响酶的活性,如需进一步进行活性测定,务必保证固定的实验条件,严格按照程序操作。

  思 考 题

1. 为何整个实验应在低温条件下进行?

2. 分离过程中,各个步骤的沉淀和上清分别为什么成分?

 

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