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第二十六章 微生物学实验
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第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
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附录

 
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第二节 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2009-06-02 14:03  

【实验目的】

熟悉蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理,掌握蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法,了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围。

【实验原理】

蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒,在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时,蛋白质带负电荷,在电场中向正极移动;反之则向负极移动,这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳(electrophoresis)。不同的蛋白质由于等电点不同,在电场中的泳动速率也不同,因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和增速剂(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)的氧化-还原作用下聚合而成的。凝胶的有效孔径与它的总浓度T%成反变关系,在高浓度时,凝胶孔径小,可以筛分分子量小的多肽;低浓度时,凝胶孔径大,则可筛分大分子蛋白质。工作时,凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成,浓缩胶浓度低、孔径大,较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带,以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。

SDS是一种阴离子去污剂,能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键,使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT)或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此,在样本中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合,可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量,这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异;然而,蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。因此,当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时,迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响,而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定,蛋白质纯度的分析,蛋白质浓度的检测,免疫印迹(Western Blot)的第一步,蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等。

【器材与试剂】

1. 微型凝胶电泳装置  (如:Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ型电泳仪),电泳电源,100℃沸水浴装置,Eppendorf管,微量注射器,带盖塑料染色盒,摇床。

2. 制胶试剂 丙烯酰胺(电泳级),N,N'-甲叉双丙烯酰胺,Tris碱,SDS,TEMED,过硫酸铵,DTT或α-巯基乙醇,甘油,溴酚蓝,甘氨酸,盐酸。

3. 染色/脱色试剂 考马斯亮蓝R-250,甲醇,冰醋酸

4. 储存液

1)30%丙烯酰胺储存液:29.2g丙烯酰胺,0.8g双丙烯酰胺,加蒸馏水至100ml,储存于棕色瓶中,4℃保存1个月左右。(注意:未聚合的丙烯酰胺有神经毒性,须在通风橱内小心操作)。

2)4 ×分离胶缓冲液100ml:75ml 2mol/L Tris-HCL(pH8.8),4ml 10% SDS,21ml蒸馏水,可在4℃存放数月。

3)4×浓缩胶缓冲液100ml:50ml 1mol/L Tris-HCL(pH6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸馏水,可在4℃存放数月。

4)10% 过硫酸铵,5ml(0.5g过硫酸铵, 加5ml蒸馏水, 新鲜配置),-20℃保存一个月左右。

5)10% (w/v)SDS,10g SDS加蒸馏水100ml, 室温保存。

6)10%  TEMED  0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。

    (7) 2×上样缓冲液(10ml):0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8),4ml 50%的甘油,2ml 10% SDS, 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇(DTT),1ml 1%溴酚蓝,0.9ml蒸馏水,可在4℃存放数周,或在-20℃保存数月。

8) 5×电泳缓冲液 (1L):15.1g Tris碱,72g甘氨酸,50ml 10%SDS 加蒸馏水至1L,pH 8.3。

9)考马斯亮蓝染色液:1.0g考马斯亮蓝R-250,450ml甲醇,100ml冰醋酸,450ml蒸馏水定容至1000ml。

10)考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇,100ml冰醋酸,800ml蒸馏水。                    

【实验方法与步骤】

1. 分离胶的制备

1)凝胶中丙烯酰胺的百分比浓度(X%)与蛋白质的分辨范围

2)分离胶的配方:

     30%丙烯酰胺储存液、4 ×分离胶缓冲液、蒸馏水、10%过硫酸铵、TEMED

     灌制分离胶。

3)分离胶的灌制:

1)按说明书组装好凝胶模具,对于Bio-Rad 微型凝胶系统,在上紧夹具之前,必须确保两块凝胶玻璃板和底部的封胶橡胶条紧密接触,避免漏胶。

2)将30%丙烯酰胺储存液与4x分离胶缓冲液以及蒸馏水在一个小烧杯中混合。

3)加入过硫酸铵和TEMED后,轻轻搅拌混匀(凝胶会很快聚合,操作要迅速)。

4)将凝胶溶液用吸管沿长玻板壁缓慢加入制胶模具中,避免产生气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm(距梳子齿约0.5cm),接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后,若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面,表明凝胶已聚合。

3. 浓缩胶的配方 5%的浓缩胶4ml, 用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽

4. 浓缩胶的灌制

1)向一侧倾斜制胶模具,吸掉覆盖在分离胶上的水;将30%丙烯酰胺储存液与4x浓缩胶缓冲液及蒸馏水在小烧杯内混合,加入过硫酸铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀。

2)将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶上面,直至前玻璃板的上缘。

3)迅速将点样梳插入凝胶内,直至梳齿的底部与前玻璃板的上缘平齐。待凝胶聚合 (约30min) 后,小心拔出点样梳。

5. 预电泳 将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽,使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内;接通电源,上槽为负极,下槽为正极,80V预电泳3~5min。

6. 样品制备/上样/电泳 将20?滋l蛋白质样品与20?滋l 2×上样缓冲液,在Eppendorf管中混合,100℃加热3~5min;离心 5~10s,用微量注射器或移液器将样品(弃沉淀)缓慢滴入凝胶梳孔中;继续低电压(80V)电泳至样品进入分离胶,再将电压调至150V,保持恒压电泳,直至染料迁移至凝胶的底部(对于两块6cm×8cm×0.75mm的凝胶,约需50min),电泳结束。

小心撬开玻璃板,凝胶便贴在其中一块板上;切去浓缩胶和某一胶角(作标记)。

7. 染色与脱色 将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中,置摇床上缓慢震荡30min以上(染色时间需根据凝胶厚度适当调整)。取出凝胶在水中漂洗数次,再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h,完全脱色则需更换脱色液2~3次,震荡达24h以上。

凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。

【注意事项】

1. 凝胶不聚合的可能原因

1)试剂质量差,应使用电泳级别的试剂。

2)过硫酸铵和TEMED的量不够或失活,可增加剂量或重配新鲜的储存液。

3)凝胶聚合时温度太低,应以室温为宜。

2. 上样时,样品不能沉到加样孔底部,可能是上样缓冲液中甘油含量不足;或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。

3. 经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周,但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本,上样前应先升至室温,确保SDS沉淀溶解。

4. 注意避免电泳条带弯曲畸变:①“微笑” 现象(如图25-1所示),可能是因为凝胶中间部分温度过高,降低电压便可得到改善.②“皱眉”现象,常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。③“拖尾”、“纹理”现象,则多为样品溶解不佳,增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。④“晕轮”效应(holo effect)多为加样过量所致。

5. 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成,应将染料溶液过滤后再用。

6. 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测,须特别注意:1)已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量,并在同一块凝胶上电泳和染色。 

 思 考 题

1. 蛋白质的分辨范围为什么与凝胶中丙烯酰胺的浓度有关?

2. 如何克服SDS-PAGE中遇到的条带弯曲畸变现象?

3 需要保持蛋白质中各抗原物质的天然构象时,SDS-PAGE
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