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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第四节 PCR (多聚酶链反应)
2009-06-02 14:05  

【实验目的】

掌握PCR技术的原理,学习PCR技术的基本方法,了解PCR技术的应用范围与意义。

【实验原理】 

详见14章第2节。

【实验对象】

特定的DNA序列。

【试剂与器材】 

引物(primer),根据需扩增的DNA设计相应的引物;TagDNA聚合酶; 10×PCR缓冲液(随酶一起购买);5mmol/L dNTP贮备液(商品化产品);DNA模板(需扩增的 DNA);双蒸水;矿物油;PCR反应管;微量移液器;离心机及PCR仪。

【实验方法与步骤】 

标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中,然后根据具体的实验要求,设置一定的循环参数,进行循环扩增。具体如下:

(1) 向PCR反应管中依次加入

    DNA模板         50~300ng (约为102~105拷贝DNA)

    引物(3'→5',5'→3')各 2μl    10μmol/L  (终浓度为0.4μmol/L)

    dNTP                2μl     5mmol/L  (终浓度为0.2μmol/L)

    10×PCR缓冲液   5μl    1/10体积    (终浓度为1×)

    MgCl2           3μl     25mmol/L  (终浓度为1.5mmol/L)

    Taq DNA聚合酶   0.5μl    (终浓度约1~5U/μl)

    ddH2O           补到终体积为50μl,混匀后,离心15 s使反应成分沉于管底。

(2) 加入矿物油20~30μl(2~3滴),以避免反应液蒸发(有热盖的PCR仪可省此步骤),然后将反应管置于95℃(变性)5min。

(3) PCR的循环程序一般为:94℃~96℃变性30s, 50℃~55℃退火30~60s,72℃延伸(1kb/1~2min),循环25~30次。末次循环结束后,将反应管置于72℃温育5min,以确保充分延伸。

【实验结果检测】

PCR扩增产物的分析法:PCR扩增DNA片段只是一个重要手段,扩增片段的检测和分析才是目的,根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可鉴定扩增产物的大小;点杂交技术除可鉴定扩增产物外,还有助于产物的分型;Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小,增加检测的特异性与敏感性;最近发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA、PCR-EIA、PCR-OLA等)均有助于PCR产物的精确分析。

【注意事项】

1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键,引物过长或过短均会使特异性降低,以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3’末端与模板DNA一定要配对,但末端没有严格的限制,故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等;引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”;引物的终浓度一般为0.2~0.5μmol/L,过低会影响反应产量,过高会增加引物二聚或错配的几率。

2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性,但无3’-5’外切酶活性,因此对单核苷酸的错配无校正功能,发生碱基错配的几率为2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶,而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后,新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3,为Taq DNA聚合酶的1/18,是目前保真度最高的PCR酶(保真度=1/错误率) (数据来源:美国冷泉港实验室)。

3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感,Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合,不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度,一般以比dNTP总浓度高出0.5~1.0mmol/L为宜,Mg2+过量能增加非特异扩增。

4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率,使反应特异性下降;过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制,均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。

5. 温度循环参数中应特别注意复性温度,它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度,通过Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。

6. 减低污染的常规措施:①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置;②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性;③使用阳性和阴性对照;④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂;⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存,每个包装仅用于单次实验;⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套;⑦实验前一定要认真清洁加样器等。

 思 考 题

1. PCR技术的基本原理是什么?

2. PCR的基本反应条件有哪些?

3. 哪些因素影响PCR产物的特异性?

  

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