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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第五节 DNA印迹(Southern Blot )
2009-06-02 14:05  

【实验目的】

掌握DNA印迹技术的基本原理, 学习DNA印迹技术的操作方法,了解DNA印迹技术的应用范围。

【实验原理】

DNA印迹是1975年由英国Southern创建的。其基本原理是:DNA分子经限制性核酸内切酶酶切后,由琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子质量大小分离,然后将DNA片段变性,并使凝胶中的单链DNA片段转移到尼龙膜、硝酸纤维素膜(NC)或其他固相支持物上,此法中DNA片段由液流携带通过虹吸作用由下向上抽吸,从凝胶转移印至滤膜表面。然后与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应,用放射性自显影或酶反应显色来鉴定待测DNA分子。

DNA印迹技术主要用于对基因组DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性(RFLP)等。

【实验对象】

待测DNA。

【试剂与器材】

(1) 水平电泳装置,电泳仪,紫外灯,摇床。

(2) 待测DNA,琼脂糖,溴化乙啶,DNA探针,保鲜膜,缓冲液。

(3) 0.25 mol/L HCl

(4) 变性液:1.5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L NaOH (保存于室温)。

(5) 中和液: (pH 7.0)  5 mol/L NaCl;  0.5 mol/L Tris-HCI (保存于室温)。

(6) 转移液 (20×SSC pH 7.0):用800 ml H2O溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠,以浓 HCI调pH至7.0,用双蒸水定容至1 L。分装后高压灭菌。

(7) 2×SSC。

(8) 尼龙膜或硝酸纤维素 (NC) 膜。

【实验方法与步骤】

(1) 取适量已酶切充分的待测DNA (1 μg左右) ,于0.8%~1.25%的琼脂糖凝胶上与合适的 DNA分子量标准一同进行稳压电泳。

(2) 切去凝胶一角以标记方向,用溴化乙啶染色后拍照记录电泳结果 (拍照时,凝胶旁放一尺子,便于以后对照电泳带在膜上的位置) ,再切下一侧DNA分子量标准带。

(3) 处理凝胶以备转膜。

 1) 蒸馏水短暂漂洗凝胶(轻摇)。

 2) 将凝胶浸没入10倍于凝胶体积(约30min)的0.25mol/L HCl溶液中15~30min,使DNA脱嘌呤。蒸馏水短暂漂洗凝胶2次。

3) 将凝胶浸没入10倍体积的变性液中20min,2次,蒸馏水漂洗2次。

4) 将凝胶浸没入10倍体积的中和液中20 min,2次,使变性液被中和。

(4) 在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等。

(5) 安装虹吸转移装置:如图25-3所示,将一固体支持物置于盛有足以浸没其一半高度的20× SSC的平皿中,依次将1张Whatman 3 mm滤纸桥,3张Whatman 3 mm 滤纸,凝胶,叠放于固体支持物上,用塑料薄膜包裹凝胶边缘后,将1张在蒸馏水中平衡过的尼龙膜(或用蒸馏水浸湿,然后在20×SSC中平衡10min的NC膜),5张Whatman 3mm滤纸及一叠4cm纸巾塔依次置于凝胶的上部,再放一玻璃板,其上压重物(注意:凝胶与转印膜间应避免有气泡,滤纸、吸水纸巾等必须大小一致)。转移持续4 h以上或过夜,勿使转移液干枯。

(6) 使已转移的DNA与膜交联:取出转印膜,用铅笔在膜上标记样品孔的位置,并切去一角以标示方向。用2×SSC漂洗转印膜,然后将其放在一张Whatman 3mm滤纸上,有DNA的一面朝上,使其完全干燥。再将膜置于UV crosslinker中,在紫外光下自动交联或将NC转印膜置于可透过紫外线的塑料夹层中,带有DNA的一面朝下,置于紫外透射仪(波长在254 nm)上,以合适的照射强度进行紫外线交联,以固定DNA。

(7) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜后,将其夹于2张Whatman 3 mm滤纸之间,80℃真空干烤2h或空气干燥。转印膜干燥后可夹在2张Whatman 3mm滤纸之间,室温下放置数月。备做核酸杂交实验。

Southern Blot仅仅是将待测DNA片段从电泳凝胶中转移并固定到固相支持物上,要实现DNA探测还需完成核酸杂交实验(包括探针标记、杂交和检测三个后续实验步骤)。杂交的双方是待测核酸序列和探针,二者按碱基互补原则退火形成双链。探针是用于检测的已知核酸片段,根据标记物的不同可分为放射性(同位素)标记探针和非放射性(非同位素)标记探针。放射性标记的探针,是在探针制备过程中掺入32P-dNTP而实现放射性标记的。非同位素标记物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin,Dig)和荧光素(Fluorescein)等。待测核酸与探针杂交后,通过放射自显影、化学显色或直接在(荧光)显微镜下观察杂交信号来鉴定待测核酸分子的大小及含量(方法见第六节后附录一和附录二)。

【注意事项】

(1) 在分辨核酸电泳带所需的凝胶浓度范围内,电泳中使用的琼脂糖凝胶的浓度越低越好,并且厚度应 ≤ 7mm。转印前切去凝胶多余的边缘,因为凝胶边缘多比凝胶本身要厚,与滤膜很难紧密相贴。

(2) 电泳结束后,应在紫外检测仪下仔细观察酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解、样品量是否一致、是否有因电场强度不均匀导致样品带泳动速度不一致等。

(3) 戴手套以防手受酸碱溶液损伤,同时避免污染滤膜。取拿滤膜时使用平头镊子。

(4) 在转移过程中,如吸水纸巾全部润湿需及时更换,否则会造成缓冲液的逆流。

(5) DNA片段的大小决定其转移速度。小于1kb的DNA片段,1h即可完成转移过程。大片段 DNA的转移速度和效率则慢得多,如大于15kb的DNA片段需要18h以上。因此,当DNA片段长度大于15kb时需进行脱嘌呤(稀盐酸)及强碱水解处理,使之降解成较小的片段,从而提高转移效率。

  思 考 题

1. Southern Blot技术的基本原理是什么?

2. 影响DNA印迹效果的主要因素有哪些?

3. Southern印迹技术的应用范围有哪些?

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