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第五章 数据的记录于处理
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第七章 医学实验的数学建模
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第九章 医学实验动物及其操作技术
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第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
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第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
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第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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第七节 体外DNA重组技术
2009-06-02 14:06  

在体外将两个或多个来源相同或不相同的DNA片段连接成新的重组DNA分子,再转到特定宿主细胞中进行自主复制并表达。这是分子生物学中的基本技术。

DNA重组技术的基本程序包括:

(1)获得外源DNA:外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段,一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。

(2)载体的构建或选择:分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子,例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等,常用的载体一般为质粒;根据需要可直接从公司购买合适的载体,也可以自己构建。

(3)连接:目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体,使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同,产生三种连接方式:粘端连接、平端连接和不相配的连接。

(4)转化:将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞,使其在宿主细胞内复制扩增或表达,赋予宿主细胞新的生物特征。

(5)克隆化:重组DNA分子转化大肠杆菌后,在平板培养基上筛选出单个菌落,此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。

下面以质粒为例图示DNA体外重组的基本程序:

一、基因组DNA的制备

【实验目的】

1. 理解生物细胞基因组DNA制备方法的原理。

2. 熟悉组织细胞基因组DNA制备的基本操作。

【实验原理】

在阴离子去污剂(SDS-十二烷基硫酸钠)以及酚/氯仿/异戊醇作用下可以使细胞膜破坏,核蛋白质变性,将染色体DNA分离出来。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞。

(一)从哺乳动物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. 消化缓冲液:100mM NaCl,10mM Tris.Cl (pH8.0)

                 25mM EDTA (pH8.0),0.5% (w/v) SDS,0.1mg/ml蛋白酶K。

2. 7.5mol/L乙酸铵。

3. 100%乙醇。

4. 酚/氯仿/异戊醇。

【实验方法与步骤】

1. 将新鲜组织剪成小块并立即置于液氮中冻存;

2. 将200mg~1g的组织用预冷的研钵研碎,或用锤子将其捣为细粉末,每100mg组织用1.2ml消化缓冲液悬浮,然后于50℃摇荡温育12~18h;

3. 用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提样品,1700×g,离心10min。如果样品溶解得不好,再加1体积不含蛋白酶K的消化缓冲液,重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质,重复抽提一次,将上层(水溶液)转移至一个新离心管中;

4. 加入1/2体积7.5mol/L乙酸铵和2倍体积100%乙醇,12 000rpm离心2min;

5. 用70%乙醇洗涤,晾干,沉淀用TE缓冲液或无菌双蒸水重新溶解,使终浓度在约1mg/ml。注: 加入0.1%的SDS和1?滋g/ml无DNA酶的RNA酶,37℃温育1h,以除去残留的RNA。

    6. 重复步骤4、5。1g细胞大约能提取到2mg DNA。

(二)从植物组织中提取基因组DNA

【实验试剂与器材】

1. CTAB抽提液:2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化铵),100mM Tris.Cl,pH8.0,                20mM EDTA,pH8.0,1.4M NaCl

2. CTAB/NaCl溶液:10% CTAB,0.7M NaCl

配制方法:在80ml双蒸水中溶解4.1g NaCl,然后缓慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵),同时加热并搅拌,可加热至65℃溶解,定容终体积至100ml。

3. CTAB沉淀液:  1% (w/v) CTAB,50mM Tris.Cl (pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)

4. 高盐TE缓冲液:  10mM Tris.Cl (pH8.0),0.1mM EDTA (pH8.0),1M NaCl

 【实验方法与步骤】

1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇,使终浓度达2% (v/v)。将此溶液及    CTAB/NaCl溶液加热至65℃。对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-巯基乙醇/CTAB抽提液和0.4~0.5ml的CTAB/NaCl溶液;

2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷冻匀浆器,将植物组织粉碎成为细粉,然后将冷冻的组织转移到一个含有机溶剂的试管或烧瓶中;

3. 往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育10~60min,期间不时混匀;

4. 用等体积的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液,上下颠倒充分混合,7500×g,4℃,离心5min,回收上层水相;

5. 加入1/10倍体积的65℃预热CTAB/NaCl溶液,上下颠倒混匀;

6. 用等体积的氯仿/异戊醇抽提,混匀,离心,回收上层水相;

7. 加入1倍体积的CTAB沉淀液,上下颠倒混匀,如果沉淀可见,继续做步骤8,也可于65℃温育30min;

8. 500×g,4℃,(或约2700rpm)离心5min;

9. 移出上清,用高盐TE缓冲液重悬沉淀(按每克起始材料加0.5~1ml),如果沉淀很难溶解,于65℃温育直至所有的或大部分沉淀溶解;

10. 加入0.6倍体积异丙醇沉淀核酸,充分混匀,7500×g,4℃,离心15min;

11. 用75%乙醇洗涤沉淀物,干燥,用尽可能少的TE或水重悬(每克起始材料0.1~0.5ml)。

【注意事项】

基因组DNA分子量大,所有操作必须轻柔,酚/氯仿对皮肤有腐蚀作用,应该戴手套操作。

二、RNA的制备

【实验目的】

1. 理解生物细胞中RNA制备方法的原理。

2. 熟悉组织细胞中RNA制备的基本操作。

(一)细胞总RNA的提取

1. 异硫氰酸胍法

【实验原理】

异硫氰酸胍法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法,其基本原理是:异硫氰酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂,不仅能使细胞裂解,同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性,通过有机溶剂的分步抽提,最终可获得纯度较高的细胞总RNA。

【实验对象】

新鲜哺乳动物组织或细胞

【实验试剂与器材】

(1)GuSCN缓冲液:

4 M异硫氰酸胍(GuSCN) ,25mmol/L 柠檬酸(pH7.0),0.5% 十二烷基肌氨酸钠(SLS)。配制方法:先称取GuSCN加少量双蒸水溶解,然后加入其余成分,65℃加热使其充分溶解,4℃保存备用。

(2)GuSCN/25mmol/L β-巯基乙醇溶液:

将0.36ml β-巯基乙醇溶于200ml GuSCN缓冲中,4℃保存备用。

(3)2M NaAc (pH 4.0)

(4)0.1% DEPC-H2O:将0.1 ml DEPC加入100ml双蒸水中,室温摇晃12~24小时,然后15磅高压15min(注意:若用此水处理容器,可以不用高压处理)

(5)氯仿:异戊醇 (49:1, v/v)

(6)DEPC-H2O饱和酚:

将DEPC-H2O和酚1:1混合,室温摇晃1小时,然后静止使其分层,吸除水相,再加入DEPC-H2O重复一次,此即DEPC-H2O饱和酚。

(7) 无水乙醇

(8) 75%冰冷乙醇

【实验方法与步骤】

(1)取离心洗涤后的1×106培养细胞或相当量的研磨后的组织,加入200?滋l GuSCN/25mM)-巯基乙醇溶液,剧烈震荡使细胞裂解,此时溶液变黏稠;

(2)加入下列成分:2M NaAc (pH4.0) 25?滋l,DEPC-H2O饱和酚240?滋l,氯仿:异戊醇    (49:1,v/v) 50?滋l,剧烈震荡10秒钟,冰浴15min;

(3)4℃,10,000×g离心30min,使其充分分层,水相应透明无任何混浊 [注:RNA在上    层水相,DNA和蛋白质在中间相和酚相中];

(4)将上层水相转移至另一离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,-20℃沉淀30min,4℃,10,000×g离心20min;

(5)弃上清,加入100?滋l GuSCN缓冲液将RNA沉淀溶解,然后加入200?滋l无水乙醇,-20℃沉淀30min,4℃,10,000×g离心20min;

(6)弃上清,用75?滋l DEPC-H2O溶解RNA沉淀,加入7.5?滋l 2M NaAc (pH4.0),165?滋l无水乙醇,-20℃沉淀30min,4℃,10,000×g离心20min;

(7)弃上清,加入75%乙醇(-20℃)1ml,不要混合,4℃,7500×g离心10min;

(8)弃上清,室温自然干燥RNA沉淀 (注意:RNA沉淀不能过分干燥,否则将无法使其溶解);

(9) 用DEPC-H2O溶解RNA备用。若长期保存,应将RNA悬于75%乙醇中置-20℃。

【注意事项】

1. 所有试剂均用DEPC-H2O配制;操作中要防止RNA酶的污染,必须戴手套,戴口罩,玻璃器皿可在烤箱中180℃烘烤2h,灭活RNA酶,或者用新的。

2. Trizol试剂法:原理、试剂、器材.

用Trizol试剂(美国Gibco公司产品)在室温下可提取RNA、DNA及蛋白质,具有快速方便、提取量大等优点。

【实验方法与步骤】

(1)0.5~1×107 细胞或相当量的组织,用1ml Trizol试剂裂解细胞,摇动混合后室温孵育5~10min;

(2)加入2氯仿,震荡混匀15秒,置室温2~3min;

(3)10,000×g,4℃离心15min,将水相移至另一离心管中,加入0.5ml异丙醇,混合后室温沉淀10min,10000×g离心10min;

(4)弃上清,加入1ml 75%乙醇,不混合,7500×g离心10min;

(5)弃上清,室温下空气蒸发残存的乙醇。

3. Oligo(dT)纤维素层析法提取mRNA

【实验原理】

真核细胞的3’端有poly(A)尾,因此可用Oligo(dT)纤维素结合mRNA,从而将mRNA从总RNA中分离出来。Oligo(dT)纤维素就是将Oligo(dT)15~18结合到纤维素上,制备成能特异性结合带Poly(A)尾RNA的纤维素。

【实验试剂与器材】

(1)Oligo(dT)纤维素

(2)层析柱装置

(3)1×上样缓冲液:20mM Tris.Cl (pH7.6),0.5M NaCl,1 mM EDTA.Na2 (pH8.0),0.1%十二烷基肌氨酸钠(SLS)

配制方法: 用Tris.HCl、NaCl和EDTA母液,加入各成分确切含量后,15磅高压15分钟,待溶液冷却至65℃时,加入预先在65℃水浴30min的10% SLS,至终浓度为0.1%。也可用0.05M柠檬酸钠代替Tris.HCl。然后用0.1%DEPC处理整个缓冲液。

(4)洗脱缓冲液:  10 mM Tris.HCl (pH7.6),1 mM EDTA.Na2 (pH8.0),0.05% SDS

先将Tris.HCl和EDTA混合后高压,然后加10%SDS至所需浓度,此缓冲液配制后不可高压。

(5)3M NaAc (pH5.2)

(6)DEPC (焦碳酸二乙酯,sodium acid pyrophophate)处理水:0.1% DEPC双蒸水,37℃摇动温育至少12h,然后15磅高压15min。

【实验方法与步骤】

(1)将0.5~1g的Oligo(dT)纤维素悬于0.1M NaCl溶液中,然后用0.5~1ml装柱;用3倍柱容积的DEPC-H2O洗柱,再用1×上样缓冲液洗柱,至洗出液pH<8.0;

(2)将RNA溶液在65℃加热5min,然后迅速冷却至室温,加入等体积的2×上样缓冲液,混合后直接上样,并收集流出液。重复此过程2-3次以使mRNA更充分地结合到纤维素上;

(3)用2~3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱mRNA;

(4)加入1/10容积的3M NaAc (pH5.2)于mRNA洗脱液中,混合后加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇,混匀后-20℃沉淀30min;

(5)10000×g,4℃离心15min,弃上清。用70%乙醇漂洗,10000×g离心5min,弃上清,室温蒸发乙醇;

(6)用适量的无RNase污染的水溶解mRNA。此mRNA可用于Northern印迹,RT-PCR及核酸保护试验。若长期保存,可加入3倍体积的无水乙醇,置-70℃。

【注意事项】

(1)因为RNA易被RNase降解;整个操作不能有RNase的污染,同时要注意无菌操作。

(2)所有试剂的配制均用DEPC处理过的水

(3)加入3倍体积的100%乙醇于RNA溶液中,-70℃可长期保存.

(4)此RNA可用于第一股cDNA的合成,Northern印迹,核酸酶保护试验等。

三、质粒DNA的制备

【实验目的】

熟悉质粒DNA常用的制备方法

【实验原理】

 转化细胞中的质粒DNA制备主要包括三个步骤:细菌的培养、收获和裂解、质粒的分离和纯化。低浓度的碱和SDS可以有效地裂解细菌的细胞壁,从而使质粒释放出来。

【实验试剂与器材】

1. 细胞悬浮液:  50mM葡萄糖,25mM Tris.Cl,( pH8.0),10mM EDTA.Na2,(pH8.0)

2. 细菌裂解液:  0.2mol/L NaOH,1% SDS

3. 中和液:  60ml 5M醋酸钾,11.5ml 冰醋酸,28.5ml双蒸水

4. 3mol/L NaAc  (pH 5.2)

5. TE饱和酚 (pH8.0)

6. 氯仿/异戊醇 = 24:1

7. RNase(20mg/ml)

【实验方法与步骤】

(一)质粒的小量制备:

1. 将5ml LB培养液(含筛选抗生素)加入到容量为15ml并通气良好的试管中,然后将转化菌的一个单菌落接种于培养液中,37℃以225rpm速度振荡培养14-16h;

2. 10,000rpm,4℃离心5min,弃培养液;

3. 用预冷的细胞悬浮液将菌体悬浮起来,室温放置5min; 

4. 加入细菌裂解液,上下颠倒微量离心管以裂解细菌,待溶液变黏稠为止;

5. 加入中和液,上下颠倒混合后置冰上5min,12,000rpm,4℃离心5min;

6. 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物),加入等体积的TE饱和酚/ 氯仿(1:1)混合液,振荡混匀1min,12,000rpm离心2min;

7. 将上层水相移至另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液,振荡混匀1min,12,000rpm离心2min;

8. 将上层水相移至另一离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,置-20℃沉淀15-30min,然后12,000 rpm离心15min;

9. 弃上清,于沉淀中加入100?滋L双蒸水或TE(pH8.0)溶解沉淀,加入20?滋g/ml RNase,置室温30min,然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀1min,12,000rpm离心2min,将上层水相移至另一离心管中,加入0.1倍体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,置-20℃沉淀15~30min,然后离心15min;

10. 弃上清,加入70%乙醇( 注意不要混合),12000rpm离心10min;

11. 弃上清,真空干燥或自然干燥质粒DNA;

12. 用去离子水溶解质粒DNA,-20℃保存备用。

(二)质粒的大量制备:

1. 将5ml转化菌种接种于500ml LB培养液(含用于筛选的抗生素)中,37℃以225rpm速度振荡培养12~16小时;

2. 10,000rpm,4℃离心15min收集菌体;

3.将细菌悬浮于100ml预冷的STE(0.1M NaCl,10mM Tris.Cl,pH8.0,1mM EDTA,pH8.0)中,12,000rpm离心收集菌体;

4. 将菌体悬于10ml细菌悬浮液中,再移至50ml离心管中;

5. 加入1ml用10mM Tris.Cl (pH 8.0)新鲜配制的溶菌酶溶液(10mg/ml),混合后室温孵育30min;

6. 加入15ml新鲜配制的细胞裂解液,上下颠倒混合直至溶液变黏稠为止;

7. 加入10ml预冷的中和液,上下颠倒混匀,冰浴10min;

8. 12,000rpm,4℃离心20min;

9. 将上清通过四层消毒纱布滤入另一50ml离心管中,加入0.6倍体积的异丙醇,室温放置10min,12,000rpm,室温离心5min;

10. 弃上清,于沉淀中加入水和RNase,置室温30min,然后用氯仿/异戊醇(24:1)抽提一次,于上层水相中加入0.1倍体积3M NaAC(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇,-20℃ 沉淀15min,12,000rpm离心15min;

11. 弃上清,用75%乙醇室温洗一次,12,000rpm,离心10min;

12. 弃上清,真空干燥或自然干燥质粒DNA;

13. 加适量去离子水或TE缓冲液(pH8.0)溶解质粒DNA,-20℃保存备用。

四、 DNA酶切,电泳分离与片段的回收

【实验目的】

掌握常用限制性内切酶的作用特点以及使用方法。

掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的操作与DNA片段的回收。   

【实验原理】

目的DNA被限制性核酸内切酶水解后产生大小不同的DNA片段,这些DNA片段在一定浓度的琼脂糖凝胶电泳上可以按分子大小不同而分开,并可以用不同的方法再把这些DNA片段从琼脂糖凝胶上回收回来。   

 限制性核酸内切酶水解DNA的活性与酶的单位数,缓冲液的离子强度和反应温度有关。

【实验试剂与器材】

限制性内切酶 

10×内切酶缓冲液

琼脂糖

(一)DNA分子的酶切消化

【实验方法与步骤】

DNA分子用限制性内切酶消化,通常按下列比例进行:

     双蒸馏水                       适量

     10×内切酶缓冲液           1/10体积

     DNA                        1μg

限制性内切酶            1/10体积 (DNA用1-10U)

总体积 混匀后37℃温育30~120min

(二)DNA酶切片段的琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

核酸在pH高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。琼脂糖凝胶具有多孔的网状结构,以其为介质进行电泳时,不同大小的核酸可借凝胶的分子筛作用而得以分开。用溴化乙啶染色后,在紫外灯下,可见橘红色的核酸条带。琼脂糖凝胶常制成水平平板状,电泳缓冲液覆盖在平板表面,加样后,通电进行电泳,故称为潜水式电泳。

【实验试剂与器材】

1. 5×TBE: 54g Tris碱,27.5g硼酸,20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0),配1升。

2. 0.5xTBE: 取5×TBE 作10倍稀释

3. 溴化乙啶液: 10mg/ml水

4. 6×载样缓冲液: 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液

【实验方法与步骤】

1. 铸胶 1g琼脂糖加0.5xTBE缓冲液100ml,在微波炉上加热融化,冷却至放在手背不觉烫手(约50℃)后,倾入架有样品孔形成器(梳子)的微型水平电泳槽中。胶液固化后,倒入0.5xTBE至高出胶面1~2mm,拔出梳子,接好电源线(注意正负极)。

2. 加样  核酸样品中加入样品体积1/6的6x载样缓冲液,混匀后,用移液器加入样品孔内。

3. 电泳 接通电源,施加的电压应小于5v/cm,待溴酚蓝跑至适当位置时,关闭电源。

4. 染色和结果观察   向微型电泳槽内滴加溴化乙啶液,至终浓度约为0.5μg/ml,混匀后放置约30min,在254nm紫外灯下观察电泳结果,做好记录。

【注意事项】

1. 溴化乙啶是致癌剂,并有中度毒性,实验中要戴防水手套,不要污染环境。紫外灯下观察结果时,应戴防护眼镜。

2. 也可将溴化乙啶预先加入琼脂糖中,使浓度达0.5μg/ml进行配胶。

3. 琼脂糖的浓度一般用0.8%~1.2% ,可随欲分离核酸分子的大小作调整,分子大用低浓度凝胶,分子小用高浓度胶。分离RNA时要用变性胶。

(三)DNA酶切片段的回收

【实验方法与步骤】

1. 冻融法:

(1)在UV灯下,用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下,-70℃冷冻至少15min,然后在65℃水浴中使胶融化;

(2)加入等倍体积TE-饱和酚,剧烈振荡30秒钟,然后-70℃冷冻15min;

(3)室温融化后,12,000rpm离心5min,将上层水相移至另一离心管中,用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉淀DNA片段,离心后的沉淀用75%乙醇漂洗一次,室温干燥DNA,用双蒸水或TE缓冲液溶解DNA后,-20℃保存备用。

2. 低熔点琼脂糖法:

(1)在UV灯下,用手术刀片在待回收DNA片段前方挖一槽,然后用同样浓度的低溶点琼脂糖将槽填平,继续电泳至待回收DNA片段进入低熔点琼脂糖中;

(2)在UV灯下,用手术刀片将含DNA的低熔点琼脂糖凝胶切下,37℃水浴10min至凝胶融化为止;

(3)加入等体积的TE饱和酚/氯仿(1:1)抽提,12000rpm离心5min;

(4)将上层水相移至另一离心管中,用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/L NaAc(pH5.2)沉出、75%乙醇漂洗一次,晾干备用。

3. DNA回收试剂盒(玻璃乳法):

(1)在UV灯下,从琼脂糖凝胶上切下含DNA片段的凝胶,放入一离心管中;

(2)加入3倍体积的6mol/L NaI溶液,45~55℃水浴5~10min使胶完全融化;

(3)加入10?滋l玻璃乳悬液,轻弹管底混匀,然后45~55℃水浴5~10min,期间每2~3min混匀一次;

(4)5000rpm离心30~60秒,弃上清;

(5)加400?滋l漂洗液(20mM Tris.Cl,pH7.4/1mM EDTA/100mM NaCl和等体积无水乙醇),轻弹管底混匀,然后同上离心弃上清;

(6)再加入漂洗液,轻弹管底混匀,然后同上离心弃上清,并用加样器尽量除净漂洗液,然后室温晾干;

(7)加10~30?滋l无菌双蒸水或TE缓冲液将玻璃乳悬浮起来,45~55℃水浴5~10min;

(8)10000rpm离心1~2min,回收上清备用。

【注意事项】

漂洗玻璃毛时不可用加样器上下吹打,从玻璃毛上洗脱DNA时则相反。

五、  载体与DNA片段的连接反应

【实验目的】

学习和掌握DNA连接酶的使用原则和基本方法

【实验原理】

DNA连接酶可以在两个双链DNA分子相邻的5'-磷酸与3'-羟基之间形成磷酸二酯键,从而可以实现重组DNA分子的构建。一般在连接反应之前,DNA分子都要进行限制性内切酶消化,使待重组的DNA分子具有相匹配的末端,黏性末端连接和平齐末端连接是最常用的,但不匹配的末端也可以经过修饰实现连接。

下面以质粒DNA为载体,介绍目的DNA片段与载体的连接。

黏性末端的连接涉及三种情况:①载体和DNA片段经双酶切后,两端具有不同的粘端,可以直接进行连接反应。②载体和DNA片段单酶切后,在DNA片段两端是互补的粘端。DNA片段插入载体时具有正反两个方向。③平齐末端连接需要在DNA5'-端去磷酸化,否则线性载体DNA分子将发生自身环化连接。

(一)5'-端去磷酸化反应

通常只对载体DNA分子进行5'-端去磷酸化反应就基本可以避免自身环化连接。

【实验试剂与器材】

1. 小牛肠磷酸酶 (Calf intestine phosphatase ,CIP)

2. 10×CIP缓冲液

【实验方法与步骤】

1. 酶切DNA反应,在75℃加热15min灭活酶活性;

2. 10×CIP缓冲液和1U CIP,混合后,37℃孵育30~60min,然后75℃加热15min灭活CIP活性;

3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的DNA片段用于连接反应。

(二)连接反应

【实验试剂与器材】

1. T4 DNA连接酶

2. 10×T4连接酶缓冲液

【实验方法与步骤】

反应体系:

      质粒DNA (0.5(g/?滋l)             2?滋l

      DNA插入片段(300ng/?滋l)      5?滋l

      10× 连接缓冲液               1?滋l

      T4 DNA连接酶              1?滋l

      加水至总体积              10ul

      混合后置14~16℃水浴6~12h。

【注意事项】

1)通常DNA插入片段与载体DNA的摩尔比为3:1或2:1,需根据DNA分子量计算,而不取决于浓度;2)平齐末端连接时,插入片段的量要远远大于载体DNA的量,可以为5:1或更多,即使这样,连接效率仍然很低。3)有时DNA一端是粘端,另一端是平端,这种连接与双酶切粘端连接相似;4)不匹配末端需要连接时,首先要将末端处理成平端,然后再进行连接反应。

六、重组质粒的转化

【实验目的】

学习和掌握感受态细胞的制备方法和转化实验的基本操作。

【实验原理】

将重组质粒转入大肠杆菌的过程称为转化。转化所用的大肠杆菌需要用物理或化学方法特殊处理,使重组DNA分子容易进入细胞内,被处理后易于接纳DNA分子的细胞称作感受态细胞。下面介绍感受态细胞的制备。

【实验试剂与器材】

大肠杆菌菌株,LB培养基,100mM CaCl2 ,DMSO或2-巯基乙醇,离心机,振荡器,冰浴

【实验方法与步骤】

(一)感受态细胞的制备

1. 将大肠杆菌菌株在LB琼脂培养基上画线,37℃培养12~16h;

2.次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中,37℃以200 rpm速度振荡培养12~16h;

3.取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中,37℃以200 rpm的速度震荡培养直至A600值为0.5~0.6 (大约3h);

4. 将菌液置冰浴10min,然后2,500×g,4℃离心20min收集菌液;

5. 弃上清,倒置离心管1min除净剩余液体,然后加入10ml冰冷的100mM CaCl2液悬浮细胞,冰浴10min;

6. 4000rpm,4℃离心10min回收细胞,弃上清,每50ml原培养物再加入2ml冰冷100mM CaCl2溶液悬浮细胞;

7. 按每份200?滋l分装,4℃可保存1~2周。若需长期保存,可加甘油至终浓度为15%,置-70℃备用。

【注意事项】

大肠杆菌必须从LB培养基琼脂平板上获得单菌落,37℃过夜培养12~16h,第二天按1~5%接种,直至A600值为0.5~0.6;

(二)重组质粒的转化

1. 将感受态细胞置冰上融化,然后加入 DMSO或2-巯基乙醇,混合后加入L连接反应液(含重组质粒),温和混匀,置冰上30min;

2. 42℃水浴45秒,然后迅速放回冰中1~2min;

3. 加入2ml LB培养液,37℃轻摇荡培养1h;

4. 4,000×g离心10秒钟,弃上清,用LB培养液重悬菌体;

5. 将菌液铺于含有适当抗生素的LB琼脂培养板上,涂匀,室温放置20~30min,倒置于37℃孵箱中培养12~16h。

(三)转化细胞的筛选

【实验原理】

 1、 蓝白筛选:

以TA克隆载体pRCII转入大肠杆菌为例。TA克隆载体pRCII含有LacZ基因,多克隆酶切位点位于其间,当没有外源基因插入LacZ基因中时,LacZ基因的启动子可使此基因编码半乳糖苷酶,从而催化底物X-gal发生化学反应,菌落变成蓝色;当外源基因与pRCII载体发生连接时,LacZ基因失活,菌落呈白色;同时该质粒还含有氨苄青霉素耐药基因。根据此特性,白色菌落含有重组质粒。在用这种质粒进行克隆时,转化平板培养基中要加入0.5mM IPTG、50g/ml氨苄青霉素及140g/ml X-gal。

作为载体的质粒都含有一种或两种抗生素的耐药基因,当把这种质粒转入大肠杆菌后,此菌便获得了抵抗这种抗生素的能力。目前分子克隆所用的克隆载体多含氨苄青霉素耐药基因,所以涉及最多的是氨苄青霉素筛选。当将氨苄青霉素加入培养基中后,只有含质粒的细菌能够繁殖,而不含质粒的细菌则不能繁殖形成菌落。此种筛选不能鉴别重组质粒或自身环化的质粒。在用含氨苄青霉素耐药基因的质粒进行克隆时,转化平板培养基中要加入氨苄青霉素。

(四)质粒和菌株的保存:

1. 质粒可以在-20℃冰冻保存。

2. 菌株可在含8~15%甘油培养液中-20℃或-70℃保存。也可在半固体LB琼脂培养基中穿刺保存。

 思 考 题

1. 描述体外DNA重组的基本过程。

2. 名词解释:质粒、限制性核酸内切酶、感受态细胞、转化、α互补。

3. 限制性核酸内切酶切割DNA片段后的连接需要考虑哪些问题。

4. 构建一个克隆载体的必要条件有哪些。

 

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