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第一章 绪论
第二章 实验研究的基本要素及人员条件
第三章 文献综述及文献检索
第四章 科学研究的选题和设计
第五章 数据的记录于处理
第六章 实验报告与论文的撰写
第七章 医学实验的数学建模
第八章 基础医学实验常用仪器及器件
第九章 医学实验动物及其操作技术
第十章 血液流变学检测
第十一章 膜片钳技术
第十二章 组织细胞培养技术
第十三章 染色体分析技术
第十四章 分子生物学技术
第十五章 免疫学技术
第十六章 细菌学实验技术
第十七章 组织学技术
第十八章 流式细胞术及其应用
第十九章 电镜技术与生物医学超微结构
第二十章 激光扫描共聚焦显微镜技术
第二十一章 模拟实验
第二十二章 生理学实验
第二十三章 药理学实验
第二十四章 形态学实验
第二十五章 分子生物学实验
第二十六章 微生物学实验
第二十七章 免疫学实验
第二十八章 医学化学实验
第二十九章 药学实验
第三十章 实验动物行为学实验方法
第三十一章 综合实验
附录

 
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医学化学实验
2009-06-02 14:10  

一、 化学试剂及有关知识

化学试剂的种类很多,世界各国对化学试剂的分类和分级的标准有所区别。我国化学试剂产品有国家标准(GB)、化工部标准(HG)及企业标准(QB)三级。

(一)化学试剂分类

化学试剂产品成千上万种,按其用途可分为—般试剂、标准试剂、高纯试剂、专用试剂、指示剂和试纸、有机合成试剂、生化试剂、临床试剂等。下面简单介绍其中几种:

1. 一般试剂 一般试剂是实验室最普遍使用的试剂,按其杂质含量的多少可分为四个等级。一般试剂的级别、规格、标志以及适用范围见表28-1。

2. 标准试剂 标准试剂是衡量其他(欲测)物质化学量的标准物质,其特点是主体含量高而准确可靠。标准试剂一般由大型试剂厂生产,并严格按照国家标准检验。主要国产标准试剂的种类及用途列于表28-2中。

3. 高纯试剂 高纯试剂的主体含量与优级纯试剂相当,但杂质含量比优级纯和基准试剂都低,而且规定检测的杂质项目比同种优级纯或基准试剂多1~2倍。高纯试剂主要用于微量或痕量分析中试样的分解及试液的制备。高纯试剂也属于通用试剂,例如HCl、HF、HClO4、HNO3、H2SO4等。

4 . 专用试剂 专用试剂即具有专门用途的试剂。与高纯试剂相似,专用试剂不仅主体含量较高,而且杂质含量很低;与高纯试剂不同的是,在特定用途中有干扰的杂质成分只需控制在不致产生明显干扰的限度以下,各类仪器分析中所用试剂如色谱分析标准试剂、气相色谱载体及固定液、液相色谱填料、薄层分析试剂、紫外及红外光谱纯试剂、磁共振波谱分析用试剂等均是专用试剂。

(二) 化学试剂的选用

实验时根据实验的要求,例如分析方法的灵敏度和选择性、分析对象的含量及对分析结果准确度的要求等,合理地选用相应级别的化学试剂。由于不同规格的同一种试剂其价格相差很大,因此,在满足实验要求的前提下,选用试剂的级别应就低不就高,以免造成浪费。试剂的选用要考虑以下几点:

1. 滴定分析中常用的标准溶液,一般先用A.R.试剂粗配,再用工作基准试剂进行标定。在对分析结果要求不是很高的实验中,也可用G.R.或A.R.试剂替代工作基准试剂。滴定分析中所用的其他试剂一般为分析纯的。

2. 就主体含量而言,G.R.和A.R相同或相近,只是杂质含量不同。如果实验对所用试剂的主体含量要求高,例如常量化学分析,则应选用A.R.试剂;如果对试剂杂质含量要求严格,则应选用G.R.试剂。   

3. 仪器分析实验中一般选用G.R、A.R.或专用试剂,测定痕量成分时应选用高纯试剂。

4. 如果现有试剂的纯度不能达到某种实验要求时,往往进行一次至多次提纯后再使用。常用的提纯方法有蒸馏法(液体试剂)和重结晶法(固体试剂)。

5. 有机化学实验离不开有机溶剂及试剂,溶剂不仅作为反应介质,在产物的纯化和后处理中也经常使用。市售的有机溶剂、试剂有工业级、化学纯和分析纯等各种规格,纯度愈高,价格愈贵。在有机合成中,常常根据反应的特点和要求,选择适当规格的溶剂和试剂,以便使反应能够顺利地进行。某些有机反应对溶剂和试剂的要求较高,即使微量杂质或水分的存在,也会影响反应的速率、产率甚至成败。因此,了解有机反应中常用溶剂、试剂的性质及纯化方法也是十分重要的。

(三) 化学试剂的贮存

化学试剂的贮存也是实验室人员的一项重要工作。在一般的实验室中不宜保存过多易燃、易爆和有毒的化学试剂,应根据用量随时申购领取。为防止化学试剂失效变质,甚至引发事故,一般的化学试剂应贮存在通风良好、干净、干燥的房间,并注意防止水分、灰尘和其他物质的污染。同时要根据试剂的性质采取相应的贮存方法:

1. 见光易分解的试剂,如AgNO3、KMnO4、CHCl3、CCl4、H2O2等。

2. 与空气接触易氧化的试剂,如SnCl2、FeSO4等。

3. 易挥发的试剂,如乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯等均应储于棕色瓶中,并置于阴暗处。  

4. 容易侵蚀玻璃的试剂,如氢氟酸、含氟盐、苛性碱等应贮存于塑料瓶中,盛碱的瓶子要用橡皮塞,不能用磨口塞。

5. 吸水性强的试剂,如无水碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氯化钙、过氧化钠、浓硫酸等瓶口应严格密封。

6. 相互作用的试剂,如挥发性的酸和氨、氧化剂和还原剂应分开存放。

7. 易燃和易爆的试剂,如苯、乙醚、丙酮等易燃试剂应贮存于阴凉通风、不受阳光直射的地方;易爆炸类试剂如苦味酸、高氯酸和高氯酸盐、过氧化氢以及高压气体等,应放在低温处保存,不得与易燃物放在一起,移动或启用时不得剧烈震动,高压气体的出气口不准对着人。

8. 剧毒试剂,如氰化物、砒霜、升汞、氯化钡等,应放在保险柜中,设双门专人保管,取用时须两人在场,并做好记录,以免发生事故。

9. 特殊试剂应采取特殊贮存方法。如需低温贮存的试剂,必须存放在冰箱中;经干燥或灼烧至恒重的工作基准试剂应贮存于干燥器中;金属钠应密封于液体石蜡中;白磷要浸在水中等。

(四) 化学试剂的取用

在实验室分装化学试剂时,一般是固体试剂装在广口瓶中,液体试剂或配制的溶液盛放在细口瓶或滴瓶中,见光易分解的试剂(如AgNO3、KMnO4、H2O2、CH3Cl等)则应盛放在棕色瓶内。每一试剂瓶上都应贴上标签,标明试剂的名称、规格或浓度以及日期。并在标签外面涂上一薄层蜡来保护它。实验时,可根据需要取用各种试剂。取用试剂之前,应看清标签,以免用错试剂。取用时,先打开瓶盖(塞)将其反放在实验台上。如果瓶塞不是平顶的而是扁平的,可用食指和中指将其夹住或放在洁净的表面皿上,绝对不能把它横置台上以免玷污。取完试剂后应及时盖上瓶盖(塞),绝对禁止将瓶盖(塞)张冠李戴,然后将试剂瓶标签朝外放至原处。值得指出的是,不能用手接触化学试剂;取用试剂时要注意节约,用多少取多少;有回收价值的应放入回收瓶中。

1. 固体试剂的取用

(1)要用洁净、干燥的药匙取用。药匙的两端分别为大小两个匙,取大量固体时用大匙,取少量固体时用小匙。应专匙专用。用过的药匙必须洗净、擦干后才能再使用,以免玷污试剂。

(2)注意不要多取,多取的试剂不能倒回原瓶,可放在指定容器中供他人使用。

(3)往试管(特别是湿试管)中加入固体试剂时,可用小药匙或将药品放在对折的纸条上,再伸进试管2/3处,然后再将试管竖直,药品可全部落到试管底部。加入块状固体时,应将试管倾斜,让其沿管缓慢滑下,以免砸破试管底。

(4)若固体的颗粒较大,可在洁净、干燥的研钵中研细。注意研钵中所盛固体的量不得超过研钵容量的1/3。

(5)若取用一定质量的固体试剂,可根据固体的性质及要求的质量精度,把固体放在干净的纸、表面皿、小烧杯或称量瓶内等,于台秤或分析天平上称量。

(6)有毒药品要在教师指导下取用。

2. 液体试剂的取用

(1)从滴瓶中取用液体试剂时,要用滴瓶中的滴管。使用时,先把滴管提离液面,用手指捏紧橡皮头排出空气,再把滴管插入试剂中,放松手指即可吸入试剂。将试剂滴入试管时,须用拇指、食指和中指夹住滴管,将它悬空在试管口的上方滴加,决不能将滴管伸进试管中或触及管壁,以免玷污滴管。用后将滴管放回原滴瓶中,不可错放。装有试剂的滴管不得平放或管口向上斜放,以免试剂流入橡皮头中,腐蚀橡皮头,污染试剂。

(2)从细口瓶中取用液体试剂时,用倾注法。先将瓶塞取下,反放在台面上,左手持盛接的容器(如试管、量筒等),右手握住试剂瓶上贴标签的一面(以免倾注液体时弄脏标签),拿起瓶子并逐渐倾斜,使瓶口靠住容器壁,将试剂缓缓倒入容器中,或沿着洁净的玻璃棒注入烧杯中。倒出所需量后,将试剂瓶口在容器上靠一下,再慢慢竖起瓶子。以免遗留在瓶口的液滴流到瓶的外壁。多取的试剂绝对不能倒回原瓶。

(3)定量量取液体试剂时,可用量筒或移液管。如果不需准确量取,则不必用量筒或移液管,只要学会估计从瓶中取出的液体量即可。如定性分析实验中用滴管取用液体,lml相当多少滴,5ml溶液占试管容积的几分之几等。一般要求倒入试管中的溶液量不超过其容积的1/3。

(五) 化学危险品的分类

危险化学品等有毒有害物质是我国一种十分重要同时又是实行国际管制的特殊商品,根据海关统计,每年我国危险化学品等有毒有害物质的进出口种类有3000余种,金额在400亿美元以上,大量危险化学品等有毒有害物质的输入对我国的环境和人民身体健康带来了越来越严重的影响。由于种种原因,我国危险化学品在国内外每年发生的各类安全事故多达上百起。所以,了解和化学危险品的安全知识是非常重要的。根据国标(GB13690-92)我国将化学危险品共分八大类(有资料分为九类,增加第九类,即杂类):

1类:爆炸品,如TNT、三硝基苯酚等。

2类:压缩气体或液化气体,如氢气、环氧乙烷等。

3类:易燃液体,如乙醚、丙酮、石油醚、乙醇等。

4类:易燃固体,自燃物品和遇湿易燃物品,如白磷、金属钠等。

5类:氧化剂和有机过氧化物,如H2O2,KMnO4等。

6类:毒害品和感染物品,如氰化物、砷化物等。

7类:放射性物品,如60Co,3H等。

8类:腐蚀品,如强酸、强碱等。   

化学危险品的分类标志(见附图)

附图:

二、酸碱标准溶液的配制和酸碱滴定

配制酸碱并确定其浓度是化学和生物学实验室中最基本的操作,也是从事各类研究时经常进行的基础工作。本实验分两个部分:

(一)酸碱标准溶液的配制和比较

【实验目的】

1. 掌握间接法配制酸、碱溶液的方法;

2. 学习酸(碱)式滴定管的操作方法。

【实验原理】

NaOH容易吸收空气中的水蒸气及CO2。盐酸则易挥发放出HCl气体故它们都不能用直接法配制标准溶液,只能用间接法配制,然后用基准物质标定其准确浓度。当酸碱反应达到理论终点时, CNaOHVNaOH=CHClVHCl通常在误差允许的情况下,根据酸碱溶液的体积比,只要确定其中任意一种溶液的浓度,即可算出另一溶液的准确浓度。

【实验内容】

1. 间接法配制酸碱溶液;

2. 酸碱标准溶液比较滴定。

【试剂与器材】

1. 仪器 500mL玻璃塞细口瓶,10mL量筒,500mL橡皮塞细口瓶,250mL烧杯,台秤,50mL酸式滴定管,50mL碱式滴定管,250mL锥形瓶。

2. 试剂 NaOH固体,浓HCl,0.1mol/L HCl,0.1mol/L NaOH,0.05%甲基橙,0.1%酚酞。

【实验方法与步骤】

1. 配制HCl溶液 用洁净量筒量取3.5mL浓HCl,用蒸馏水稀释至500mL后,转入磨口试剂瓶中,盖好瓶塞,充分摇匀,贴好标签备用。

2. 配制NaOH溶液 用烧杯由台天平迅速称取2g固体NaOH,加约30mL无CO2的蒸馏水溶解,稀释至500mL,转入橡皮塞试剂瓶中,盖好瓶塞,摇匀,贴好标签备用。标签写明:试剂名称、浓度、配制日期、专业、姓名。

3. 滴定练习

(1) 由“碱管”放出10mL0.1mol / L NaOH溶液于锥形瓶中,加10mL蒸馏水,再加入1~2滴甲基橙指示剂,用0.1mol / L HCl溶液滴定至由黄色变橙色。

(2) 由“酸管”放出10mL 0.1mol / L HCl溶液于另一锥形瓶中,加l0mL蒸馏水,再加1滴酚酞指示剂,用0.1mol / L NaOH溶液滴定至终点(微红),0.5min不褪色。

(3)酸碱相互回滴,反复辨认终点颜色,控制好滴定速度。

4. 酸碱标准溶液比较滴定

(1) 将酸(碱)式滴定管分别装好“标准溶液”至零刻度以上,并调整液面至“0.00”刻度附近,准确记录初读数。

(2) 由碱管以10mol / L min的流速放出20ml(读准至0.01 mL)的NaOH 溶液至锥形瓶中,加1~2滴甲基橙,用HCI标准溶液滴定至溶液由黄色变成橙色,记录所耗HCI溶液的体积。

(3) 平行测定2~3次。(每次测定都必须将酸、碱溶液重新装至滴定管的零刻度线附近。

【注意事项】

1. 注意终点时滴定速度;

2. 学会半滴操作;

3. 判断终点,注意掌握0.5min不褪色;

4. 环保提示:HCI易挥发,有刺激性,注意通风,酸、碱溶液排放前要中和。

【数据处理】

  思 考 题

1. 本实验中配制酸碱标准溶液时,试剂只用量筒量取或天平称取,为什么?

2. 稀释所用蒸馏水是否需准确量取?

3. 用HCl溶液滴定NaOH溶液,甲基橙变色时,pH范围是多少,此时是否为化学计量点?

 

(二)酸碱标准溶液的标定

【实验目的】

1. 学会以碳酸钠为基准物质标定盐酸,再用已标定的盐酸滴定氢氧化钠溶液准确浓度的方法;

2. 掌握容量瓶、移液管和分析天平的使用方法。

【实验原理】

NaCO3+2HCI=H2O+CO2+NaCI

HCI+NaOH= NaCI+ H2O

【实验试剂与器材】

1. 仪器 分析天平,50mL酸式滴定管,50mL碱式滴定管,250mL锥形瓶,200mL容量瓶,小烧杯,50mL量筒,25mL移液管。

2. 试剂 干燥的基准碳酸钠,待标定的0.1mol / L HCl,0.05%甲基橙。 

【实验方法与步骤】

1. 基准物质碳酸钠溶液的配制 在分析天平上用差减法准确称取0.9~1.2g基准碳酸钠于干净小烧杯中,加20~30mL蒸馏水溶解,然后小心转入200mL容量瓶中,用少量蒸馏水淋烧杯3~4次,洗液全部转入容量瓶中,然后加蒸馏水至刻度,混匀,计算出准确浓度,贴上标签备用。

2. 用碳酸钠标准溶液标定0.1mol/L HCl 溶液的准确浓度 取酸式滴定管用待标定的0.1mol/L HCl淋洗2~3次,然后装入该溶液至液面在0.00mL刻度处。另取25mL移液管用上面配制的基准物质碳酸钠溶液淋洗2~3次,然后吸取该溶液25.00mL放入洁净的锥形瓶中,用少量蒸馏水将瓶壁上的碳酸钠溶液冲下,加甲基橙指示剂1~2滴,用0.1mol/L HCl滴定至溶液由黄色变为橙色,记录滴定管读数。同法重复2~3次,并计算出HCl的准确浓度。并结合实验(一),推算出0.1mol/L NaOH的准确浓度。

【数据处理】

 思 考 题

1. 移液管和量筒都是量取液体的量器,它们能否相互代用?

2. 为什么要用差量法称取基准碳酸钠?

3. 怎样减少和消除实验误差?

 

三、果品总酸度的测定

食品中的有机酸影响食晶的香味、颜色、稳定性和质量的好坏。当然,植物食品的酸度在不同的地域和不同的阶段或因其成熟程度和生长条件不同而异。如葡萄,未成熟时主要是苹果酸,随着果实的成熟,苹果酸含量减少,酒石酸含量增加,最后酒石酸变成酒石酸钾。

此外,测定果蔬的酸度和糖的相对含量比,可以判断其成熟度。如柑橘类水果的糖酸比,已用于判断柑橘的成熟度。有机酸是果蔬的特有成分,它的存在,增加果蔬酸味。果蔬中含有的酸种类很多——有机酸、无机酸、酸式盐以及某些酸性有机化合物(如单宁、蛋白质分解产物和果胶质分解产物等),当然也包括最重要的Vc成分抗坏血酸。通常,无机酸呈中性盐状态存在于果蔬中,而有机酸部分呈游离状态,部分呈酸式盐状态。

食品中酸性成分各异,某些生活中的日用品也和食品一样,有其最合适的酸度要求。测定果品中的酸度有助于了解酸碱滴定在我们日常生活中的实际应用。

【实验目的】

1. 学习酸碱滴定法的方法、原理与应用。 

2. 了解食品在测定前的一般处理方法。 

【实验原理】

水果中富含有机酸,如乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸等,这些有机酸可以用碱标准溶液滴定,以酚酞为指示剂。根据所消耗的碱浓度和体积,即可求出果品中的总酸度:

        有机酸%= CNaOH·VNaOH K/Mx×100%         

式中:  Mx为实际滴定的试样量(g);

VNaOH为滴定果品本身所消耗的NaOH标液量(ml);

CNaOH为滴定果品NaOH浓度(mol/L);

K为有机酸基本单元的式量MB×10-3,其取值参考下表

分析芸香科柑橘类果实和越橘科浆果时按柠檬酸计算。分析果、核果类及大部分浆果类时按苹果酸计算。由于果品中酸值较低,故应对所用去离子水作空白实验。

【实验试剂与器材】

1. 仪器 电子天平(准至0.01g),碱式滴定管,锥形瓶,匀浆器,250ml容量瓶,烧杯,  过滤装置,移液管。 

2. 试剂 NaOH固体(或标液),酚酞指示剂,水果样品。

【实验步骤与方法】

取甜橙,去皮去膜去络去核,将剩余部分置于研钵中,捣碎,称取制成糊状的果肉约20g(准至小数后两位)于洁净干燥的小烧杯中,用纱布过滤至小锥形瓶中,再将纱布挤干,得到的汁液再用棉花过滤。将汁液定容在250mL容量瓶中,摇匀。移取25.00ml滤液于锥形瓶中,加1~2滴酚酞指示剂,以NaOH标液(V)滴定至终点(粉红色,且0.5min不褪色)。平行测定2~3次。

另移取25.00mL去离子水,以NaOH标液滴定至酚酞终点。平行测定2~3次。

【数据处理】

 思 考 题

1.  做空白实验的目的是什么?

2. 测定时,用什么仪器称取果品试样?

3. 本测定中,将样品残渣也一起进行定容,对结果有无影响?

4. 新制橙汁与橙汁上清液的pH有差别吗?通过对比实验来比较。

5. 果品的口感和酸度是什么关系? 

 

四、考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量

【实验目的】

1. 学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue ,CBB)法测定蛋白质浓度的原理和方法。

2. 学会标准曲线的制作方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250存在两种不同的颜色形式,红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer?蒺s law)。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式变为蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h,之后蛋白质和染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质和染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,在测定溶液中含蛋白质5μg/mL时就有0.275光吸收值的变化,比Lowry法灵敏4倍,测定范围为10~100μg蛋白质,微量测定法测定范围是1~10μg蛋白质。此反应重复性好,精确度高,线性关系好。此方法干扰物少,研究表明:NaCl,KCl,MgCl2,乙醇,(NH4)2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰,这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。

考马斯亮蓝(CBB) 法由于方法简单, 显色剂单一, 反应迅速等更被常用。但对于大批量而蛋白质含量又少的样品测定, 常量法 (MC) 测定比较费时、费试剂, 且CBB与蛋白质结合物易吸附在比色杯上, 不易清洗, 重复使用会影响测定结果。因此, 我们建立了考马斯亮蓝酶联免疫检测仪微盘比色测定法(MPC)。

【实验试剂与器材】

1. 仪器 试管,试管架,移液管(0.1ml及5ml),移液器(10μl可调, 200μl可调),玻璃均浆器,眼科剪,镊子,天平,分光光度计,96孔板,酶联免疫检测仪。

2. 试剂及其配制

1)考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G 250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000ml,用滤纸过滤避光保存备用。

2)标准牛血清白蛋白(BSA)溶液 蛋白浓度为0.5g/l, 以生理盐水配制。

3)生理盐水。

【实验方法与步骤】

1. 样品制备 颈椎脱臼处死小鼠,剖腹取小鼠肝组织,用生理盐水制成5g/L的匀浆。如有块状不溶物,会造成加样误差,应先以500 rpm离心5min,取上清液备用。

2. 标准曲线的绘制 

常量法:

在试管中分别加入BSA标准液: 12. 5, 25, 50, 75, 100, 125, 150 μl (即含BSA分别为6. 25, 12. 5, 25, 37. 5, 50, 62. 5, 75μg) , 然后分别加生理盐水补充使其体积为200μl,空白管加200μL 生理盐水, 混匀后各加考马斯亮蓝显色液4000μl,摇匀, 室温放置5 min 后, 在595 nm比色测光密度。

微量法:

96 孔板中分别加入BSA 标准液1. 25, 2. 50, 3. 75, 5. 00, 6. 25, 7. 50 μL (含BSA 分别为0. 625, 1. 250, 1. 875, 2. 500, 3. 125, 3. 750 μg),再用生理盐水补充使每孔液体体积为10 μl, 空白孔只加生理盐水10 μl, 慢慢摇匀后,分别各加CBB 显色液200μl摇匀, 室温放置5 m in 后, 在酶联免疫测定仪600 nm 直接测定吸光度。将各自测定的结果在作直线回归,并作图。

3. 样品蛋白含量测定

测定方法同上,取合适体积的未知样品液,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据分别所测定的A595nm,600 nm值,从回归方程计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

4. 从测定结果计算出样品的蛋白质浓度,并用统计学方法说明两种测定方法的相关性。

【注意事项】

1.  Tris,乙酸,2-巯基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污剂如Triton X-100,SDS,玻璃去污剂有少量颜色干扰,用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是,大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

2. 如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。

3. 测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,对测定结果会有一定的影响,所以常量法每测定完一样品后要用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

4. 如有全波长的酶联免疫检测仪,测定波长就选600nm。

  思 考 题

1. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质的原理是什么?

2. 如何避免测定误差?

3. 试比较两种测定方法的优缺点。

 

五、缓冲溶液的配制及pH值测定

【实验目的】

1. 了解缓冲溶液的配制原理及缓冲溶液的性质。

2. 掌握缓冲溶液配制和pH测定的基本方法。

【实验原理】

溶液pH值的测定,在自然科学各个领域中都有广泛的应用,在医药领域中有着非常重要的意义。例如合成或分析反应条件的控制,注射液或其他药剂的配制等,经常需要准确测定pH值。所以溶液pH值的测定是仪器分析中普及程度非常高的一种方法。

① 基本概念 在一定程度上能抵抗外加少量酸、碱或稀释,而保持溶液pH值基本不变的作用称为缓冲作用。具有缓冲作用的溶液称为缓冲溶液。

② 缓冲溶液组成及计算公式 缓冲溶液一般是由共轭酸碱对组成的,例如弱酸和弱酸盐,或弱碱和弱碱盐。如果缓冲溶液由弱酸和弱酸盐 (例如HAc-NaAc)组成,则

③缓冲溶液性质 a.抗酸/碱,抗稀释作用 因为缓冲溶液中具有抗酸成分和抗碱成分,所以加入少量强酸或强碱,其pH值基本上是不变的。稀释缓冲溶液时,酸和碱的浓度比值不改变,适当稀释不影响其pH值。b.缓冲容量缓冲容量是衡量缓冲溶液缓冲能力大小的尺度。缓冲容量的大小与缓冲组分浓度和缓冲组分的比值有关。缓冲组分浓度越大,缓冲容量越大;缓冲组分比值为1时,缓冲容量最大。

【实验试剂与器材】

1. 试剂 HAc(0.1mol/L,1 mol/L),NaAc(0.1mol/L,1mol/L),NaH2PO4(0.1mol/L,1mol/L),Na2HPO4(0.1mol/L,1mol/L),NH3·H2O (0.1mol/L,1mol/L ),NH4Cl (0.1mol/L),HCl(0.1mol/L),NaOH(0.1mol/L,1mol/L),pH=4的HCl,pH=10的NaOH,pH=4.00标准缓冲溶液,pH=9.18标准缓冲溶液,甲基红溶液,广泛pH试纸,精密pH试纸。

2. 器材 酸度计,试管,量筒(100ml,10ml),烧杯(100ml,50ml),吸量管(10ml),吸水纸等。

【实验步骤与方法】

1. 缓冲溶液的配制与pH值的测定 按照下表,通过计算配制三种不同pH值的缓冲溶液,然后用精密pH试纸和pH计分别测定它们的pH值, pH计的使用要严格按照仪器说明书操作,事先要用适当的pH标准物质校准。测量完毕后,将测定结果进行比较,看理论计算值与两种测定方法实验值是否相符(溶液留作后面实验用)。

2. 缓冲溶液的性质 ① 取3支试管,依次加入蒸馏水,pH=4的HCl溶液,pH =10的NaOH溶液各3mL,用pH试纸测其pH值,然后向各管加入5滴0.1 mol/L HCl,再测其pH值。用相同的方法,试验5滴0.1 mol/L NaOH对上述三种溶液pH值的影响。将结果记录在表2中。② 取3支试管,依次加入自己配制的pH=4.0、pH=7.0、pH=10.0的缓冲溶液各3mL。然后向各管加入5滴0.1 mol/L HCl,用精密pH试纸测其pH值。用相同的方法,试验5滴0.1 mol/L NaOH对上述三种缓冲溶液pH值的影响。将结果记录在表2中。③ 取5支试管,依次分别加入pH=4的HCl溶液,pH=10的NaOH溶液及pH=4.0缓冲溶液、pH=7.0缓冲溶液、pH=10.0的缓冲溶液各1ml,用精密pH试纸测定各管中溶液的pH值。然后向各管中加入10ml水,混匀后再用精密pH试纸测其pH值,考查稀释上述五种溶液pH值的影响。将实验结果记录于表2,通过以上实验结果,说明缓冲溶液的什么性质。

 3. 缓冲溶液的缓冲容量 ① 缓冲容量与缓冲组分浓度的关系 : 取两支大试管,在一试管中加入0.1 mol/L HAc和0.1 mol/L NaAc各3ml,另一试管中加入1 mol/L HAc和1 mol/L NaAc各3ml,混匀后用精密pH试纸测定两试管内溶液的pH值(是否相同)?在两试管中分别滴入2滴甲基红指示剂,溶液呈何色?(甲基红在pH<4.2时呈红色,pH>6.3时呈黄色)。然后在两试管中分别逐滴加入1 mol/L NaOH溶液(每加入1滴NaOH均需摇匀),直至溶液的颜色变成黄色。记录各试管所滴入NaOH的滴数,说明哪一试管中缓冲溶液的缓冲容量大。② 缓冲容量与缓冲组分比值的关系: 取两支大试管,用吸量管在一试管中加入NaH2PO4和Na2HPO4各10ml,另一试管中加入2ml 0.1mol/L NaH2PO4和18ml 0.1mol/L Na2HPO4,混匀后用精密pH试纸分别测量两试管中溶液的pH值。然后在每试管中各加入1.8mlmol/L NaOH,混匀后再用精密pH试纸分别测量两试管中溶液的pH值。说明哪一试管中缓冲溶液的缓冲容量大?

 思 考 题

1. 为什么缓冲溶液具有缓冲作用?

2.  NaHCO3溶液是否具有缓冲作用,为什么?

3.  用pH计测定溶液pH值时,已经标定的仪器,“定位”调节是否可以改变位置,为什么?

       4. 如何配制一个pH=7.40.1 mol L NaH2PO4 -Na2HPO4缓冲溶液?试画出简单框图。
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