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蛋白质转导技术及其在大分子物质转运中的应用
2009-06-15 11:25   发布范围:公开

口腔医学系学员二队  梁  洁

摘  要 蛋白质转导结构域是指一类小分子多肽,它能够携带其他生物大分子穿过多种细胞膜。现在已经用于多种大分子甚至微小颗粒的细胞内转运,如蛋白质、多肽、抗体、DNA、寡核苷酸、甚至脂质体等,在蛋白质功能研究、治疗疾病以及药物开发等方面都具有潜在价值。

关键词 蛋白质转导结构域;蛋白质转导


0 引言

    蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)是指一类小分子阳离子多肽(<20个氨基酸),能够携带其他生物大分子(蛋白质、多肽、DNA等)穿过多种哺乳动物细胞膜并使其在细胞内积聚。至今发现的具有PTD的多肽有:HIV的转录激活因子(trans—activator transcription,TAT),果蝇转录蛋白触足(antennapedia,Antp),单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)的VP22转录因子,多聚精氨酸等。

1 蛋白转导结构域的作用特点

    PTD的转导作用的特点:首先,PTD可以转导多种不同大小的物质,如多肽和蛋白质(酶、单克隆抗体、转录因子等),寡核苷酸、DNA、噬菌体、脂质体、小分子有机化合物等;其次,PTD导入的细胞谱广泛,几乎能将介导的外源分子导入所有的哺乳动物细胞;再次,PTD转导效率高,几乎可以达到100%。另外,PTD的转导作用迅速,有文献报道在培养基内加入PTD后5min就可以在细胞内检测到[1]。由于PTD作用的上述特点,它在基础研究和应用研究中显示出明显的优势。

2 蛋白转导结构域的作用机制

    尽管1988年就已经发现了蛋白转导现象,而且蛋白转导结构域已经成功用于介导多种大分子的细胞内运输,但是其进入细胞的机制仍然不清楚,而且不同的试验结果支持不同的细胞进入机制。

    一般认为,PTD的跨膜转导过程可分为3步:第一步可能包括PTD侧链的碱性基团与细胞膜表面带有负电荷的离子间的相互作用。

   一些研究细胞表面蛋白聚糖的报告指出,蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素,在转导过程中的作用相当于细胞外的蛋白或多肽的受体;硫酸肝素或粘多糖合成缺陷的细胞系对多聚赖氨酸、Antp和TAT介导的蛋白质转导作用的敏感性降低[2]。与此相反,其他一些研究表明,蛋白聚糖与蛋白转导过程之间缺乏关联性[3]

    第二步,在前一步的相互作用下,PTD及其偶联的大分子穿过细胞膜,机制目前尚不十分明确。

   有研究表明,TAT和transportan进入细胞遵循不饱和的、剂量依赖的方式,在37°C和4°C之下均可被细胞有效摄入;而且应用内吞的一般抑制药物也不能够抑制转导作用;这些实验结果均不支持细胞内吞的作用机制[4]

    应用Antp的反式螺旋结构时发现仍然可以转导通过生物膜;这一实验结果不支持配体/受体的作用机制[5]

    第三步,被PTD导入的生物大分子在细胞内发挥生物学效应。

    总体来说,近来的大量研究均认同,多种机制参与了PTD介导的各种分子和颗粒的细胞内转运。无论哪种机制,穿梭部分与细胞膜或细胞膜相关蛋白聚糖的直接接触在细胞内转运中都是必需的。

3 蛋白质转导结构域介导的蛋白质转运

   PTD介导的蛋白质转运技术,为研究蛋白质生物学功能提供了新的方法,已经成功用于未知蛋白质的功能或已知蛋白质之间的相互作用的研究。与目前所采用的方法相比,病毒载体和脂质体转染系统是将cDNA导入活细胞,而PTD能够绕过核酸的参与,直接将所研究的蛋白质导入细胞内,避免了上述方法的局限性,如病毒的细胞毒性等。

    TAT在体外实验中能够转运异源蛋白质进入体内的多种细胞,如β-半乳糖苷酶,RNA酶,以及辣根过氧化物酶。体内试验TAT-β半乳糖苷酶复合物可以转运到达多种组织,在心脏、肝脏、脾脏中浓度高。腹腔注射116kD的β-半乳糖苷酶与TAT的融合产物,具有生物活性的融合蛋白可以到达小鼠所有组织,包括脑组织[6]

    TAT介导的蛋白转运在疫苗设计中可能具有应用潜力。外源性蛋白不能进入细胞质中引发MHC-1类分子的抗原提呈途径,因此,设计出蛋白疫苗很难引起Ⅰ类分子限制的细胞毒性T细胞的免疫反应(CTL)。将具有抗原性的蛋白质(如卵白蛋白)连接到TAT(49-57)上,就可以通过抗原提呈细胞提呈,引起抗原特异性CTL杀伤靶细胞[7]

    TAT PTD融合蛋白在治疗氧化应激疾病研究中的应用。编码TAT PTD 49-57的基因序列,和人铜锌过氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)基因融合后,得到的TAT-SOD融合蛋白,可以转导进入细胞,而且比自身的天然蛋白的转导效率明显增高,在与抗氧化物酶相关的疾病中,可作为一条新途径补充Cu,Zn-SOD[8]

    TAT转导结构域在调控炎症反应中的应用。转录因子NF-kB是一种炎症介质因子,促炎因子如TNF-α和IL-β通过活化NF-kB而发挥作用,因而,在慢性炎症反应中通过抑制NF-kB的活动的方法也可以治疗炎症反应。非磷酸化的不可降解的超抑制物IκBα(srIκBα)的突变型可以强烈抑制NF-kB的活动,将突变型与TAT PTD融合后的蛋白,可迅速有效的被细胞摄取,抑制TNF-α和IL-β诱发的NF-kB活化,同时抑制NF-kB介导的转录活动[9]

     TAT PTD通过树突状细胞参与肿瘤的免疫治疗。藕联了肿瘤相关抗原的TATPTD转导入树突状细胞后,树突状细胞可以表达该蛋白的抗原决定簇,即可激活细胞毒性淋巴细胞杀伤肿瘤细胞[10]。应用导入了TAT PTD-TRP2肽段的树突状细胞免疫接种,可产生完全的保护性免疫,在肿瘤模型中显著抑制了肺转移[11]

    除TAT外,单纯疱疹病毒VP22可以在肿瘤治疗中发挥作用。E2蛋白在宫颈癌细胞的过度表达可以诱发细胞生长停滞和/或细胞凋亡,所以用E2蛋白治疗宫颈癌可能有效。实验结果表明,VP22-E2融合蛋白可以诱导宫颈癌细胞系凋亡,提示VP22-E2蛋白的局部转运可以应用于治疗宫颈癌[12]

4 蛋白质转导结构域介导的抗体转运

    抗体一直以来都被用于细胞外抗原或细胞表面抗原的靶向治疗,正常情况下抗体自身不能进入胞膜完整的活体细胞,目前应用的向细胞内转运抗体的方法如电穿孔或微注射法,都有明显的局限性,可能破坏细胞膜结构、影响细胞的生长发育等,而应用PTD技术可以介导抗体直接穿透细胞膜,实现抗体的细胞内转运,从而针对细胞内抗原发挥作用。

   TAT(37-62)类似物,在体外与抗肿瘤抗体Fab片断连接后,增加了这些片段的摄入[13]

    TATp(37-72)可用于在细胞内中和破伤风毒素。破伤风毒素在神经细胞内降解极其缓慢,临床应用中需要应用抗破伤风毒素抗体发挥中和作用,传统的运输抗体的方法电穿孔技术不能应用于临床。抗破伤风毒素Fab片断与TATp (37-72)之间连接,可以被细胞所摄取,并在细胞内发挥中和破伤风毒素的作用[14]

    然而,另有一部分研究表明,结合后的抗体与未处理过的抗体相比,抗体的靶向性明显降低。因此,对于在体内应用细胞转导肽转运抗体仍然存在疑问。

5 蛋白质转导结构域在基因调控中的应用

    应用有效的蛋白质转导系统,增加了基因调控的可能性,基因转录调控蛋白可以转运进入细胞浆和细胞核,可以发挥上调或下调靶基因的作用,这种作用可由与DNA或mRNA连接或干扰特异性蛋白质-蛋白质之间的相互作用来实现。例如,有研究应用设计调控蛋白(DRP)来活化或抑制基因的转录,该蛋白中人工合成的转录因子与细胞膜穿透肽融合。DRP很快可以摄入细胞,转运至细胞核,并由其DNA结合区定向于血管内皮细胞生长因子(VEGF)-A基因,通过其激活区启动VEGF-A蛋白的转录合成及分泌[15]

    肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)可以和DNA、RNA形成稳定的复合物,而且细胞毒性低,与正常发生的寡聚核苷酸性相比,他们对核酸酶不敏感,这些特征使得他们成为理想的调控基因表达的工具。PNA是目前应用最多的寡聚核苷酸,连接PNA与肽链的最常采用的方法是通过二硫键,融合蛋白一旦进入细胞,细胞内环境条件会还原二硫键,从而释放出PNA,就可以与基因发生相互作用。例如,MAP可以转运PNA进入哺乳动物细胞,该PNA与痛敏肽FQ受体相应的序列互补。应用PNA-肽结合物预处理鼠自律心肌细胞,可降低由痛敏肽诱发的正性变时作用达10倍之多[16]

    siRNA是分子生物学研究一种重要的工具,但是和大多数以寡核苷酸为基础的药物一样,应用siRNA的主要缺点是低细胞内摄入量,应用PTD作为介导siRNA进入细胞的工具可以显著增加其细胞摄入量[17]

6 蛋白转导结构域介导其它物质的转运

   PTD可以介导显影剂,如氧化锝迅速穿透细胞膜进入细胞,并在细胞内聚集达到高浓度[18]。PTD还可以转运脂质体。研究表明TATp-脂质体转运进入细胞浆,缓慢迁移进入核周围地带。TATp-脂质体含有小量的阳离子脂质,可与DNA形成牢固的结合物[19]

7 讨论

    虽然蛋白转导结构域在体内和体外均已经成功用于介导各种大分子的细胞内运输,但仍有很多问题有待解决。PTD进入细胞的机制尚未阐明,而且PTD作用缺乏特异性,能穿过各种类型的细胞并能分布于体内的多种器官,这是目前限制PTD应用的一大局限。PTD的免疫原性、药物代谢动力学等也具有进一步研究的意义。这些问题解决后,蛋白质转导技术一定会成为研究工作的有力工具,促进蛋白质和基因功能基础研究以及药物开发取得突破性成果。

参  考  文  献

1.  M. Hallbrink, A. Floren, A. Elmquist, M. Pooga, T. Bartfai and U. Langel, Cargo delivery kinetics of cell-penetrating peptides, Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1515: 101–109.

2.  M. Tyagi, M. Rusnati, M. Presta and M. Giacca, Internalization of HIV-1 TAT requires cell surface heparan sulfate proteoglycans, J. Biol. Chem. 2001, 276:3254–3261.

3. S. Violini, V. Sharma, J.L. Prior, M. Dyszlewski and D. Piwnica-Worms, Evidence for a plasma membrane-mediated permeability barrier to TAT basic domain in well-differentiated epithelial cells: lack of correlation with heparan sulfate, Biochemistry2002, 41: 12652–12661.

4. E. Vives, P. Brodin and B. Lebleu, A truncated HIV-1 TAT protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus, J. Biol. Chem. 1997,272: 16010–16017

5. D. Derossi, S. Calvet, A. Trembleau, A. Brunissen, G. Chassaing and A. Prochiantz, Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent, J. Biol. Chem. 1996,271: 18188–18193.

6.  P. Moy, Y. Daikh, B. Pepinsky, D. Thomas, S. Fawell and J. Barsoum, TAT-mediated protein delivery can faciliTATe MHC class I presenTATion of antigens, Mol. Biotechnol. 1996,6: 105–113.

7. D.T. Kim, D.J. Mitchell, D.G. Brockstedt, L. Fong, G.P. Nolan, C.G. Fathman, E.G. Engleman and J.B. Rothbard, Introduction of soluble proteins into the MHC class I pathway by conjugation to an HIV TAT peptide, J. Immunol. 1997,159:1666–1668.

8. H.Y. Kwon, W.S. Eum, H.W. Jang, J.H. Kang, J. Ryu, B. Ryong Lee, L.H. Jin, J. Park and S.Y. Choi, Transduction of Cu,Zn-superoxide dismutase mediated by an HIV-1 TAT protein basic domain into mammalian cells, FEBS Lett. 2000,485:163–167.

9. P.S. Kabouridis, M. Hasan, J. Newson, D.W. Gilroy and T. Lawrence, Inhibition of NF-kappa B activity by a membrane-transducing mutant of I kappa B alpha,J. Immunol. 2002, 169: 2587–2593.

10. N. Shibagaki and M.C. Udey, Dendritic cells transduced with protein antigens induce cytotoxic lymphocytes and elicit antitumor immunity, J. Immunol. 2002, 168: 2393–2401.

11. H.Y. Wang, T. Fu, G. Wang, G. Zeng, D.M. Perry-Lalley, J.C. Yang, N.P. Restifo, P. Hwu and R.F. Wang, Induction of CD4(+) T cell-dependent antitumor immunity by TAT-mediated tumor antigen delivery into dendritic cells, J. Clin. Invest. 2002,109: 1463–1470.

12. G.E. Roeder, J.L. Parish, P.L. Stern and K. Gaston, Herpes simplex virus VP22–human papillomavirus E2 fusion proteins produced in mammalian or bacterial cells enter mammalian cells and induce apoptotic cell death, Biotechnol. Appl. Biochem. 2004,40: 157–165.

13. D.C. Anderson, E. Nichols, R. Manger, D. Woodle, M. Barry and A.R. Fritzberg, Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 94: 876–884.

14. S. Stein, A. Weiss, K. Adermann, P. Lazarovici, J. Hochman and H. Wellhoner, A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37–72) TAT neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells, FEBS Lett. 1999, 458:  383–386.

15.Tachikawa K, Schroder O, Frey G, Briggs SP and Sera T, Regulation of the endogenous VEGF-A gene by exogenous designed regulatory proteins, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004,101(42): 15225-30.

16.     Oehlke J, Wallukat G, Wolf Y, Ehrlich A, Wiesner B, Berger H and Bienert M, Enhancement of intracellular concentration and biological activity of PNA after conjugation with a cell-penetrating synthetic model peptide. Eur J Biochem. 2004, 271(14):3043-9.

17. F. Simeoni et al., Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2003,31: 2717–2724.

18. V. Polyakov, V. Sharma, J.L. Dahlheimer, C.M. Pica, G.D. Luker and D. Piwnica-Worms, Novel TAT-peptide chelates for direct transduction of technetium-99 m and rhenium into human cells for imaging and radiotherapy, Bioconjug. Chem. 2000,11: 762–771.

19. V.P.Torchilin,T.S.Levchenko,R.Rammohan,N.Volodina,B.Papahadjopoulos-Sternberg and G.G. D'Souza, Cell transfection in vitro and in vivo with nontoxic TAT peptide–liposome–DNA complexes, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003,100:1972–1977.



 

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