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神经干细胞研究新进展及其应用前景
2009-06-15 16:55   发布范围:公开

 预防医学系学员一队  朱 超

摘  要中枢神经系统的再生一直是困扰医学界的难题之一,而神经干细胞尤其是成年哺乳动物脑组织中神经干细胞的发具有极其重大的意义,本文拟阐述目前有关神经干细胞研究的最新进展及其应用前景。

关键词神经干细胞;移植;中枢再生

 


0 引言

中枢神经系统的再生一直是困扰医学界的难题之一,而神经干细胞尤其是成年哺乳动物脑组织中神经干细胞具有极其重大的意义,成为20世纪后10余年神经生物学领域最为重要的进展之一。它具有非常广阔的生物学研究和临床应用前景,已成为中枢神经系统损伤和疾病研究的焦点。本文拟就目前有关神经干细胞研究的最新进展及其应用前景综述如下。

1 定义和特点

神经干细胞(neural stem cells, NSCs)发现最早、最直接的证据是:1992年,Reynolds和Weiss[1]首先从成年鼠纹状体分离出具有自我更新能力,且具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多向分化潜能的NSCs,提出了被普遍认可的NSCs细胞的概念,直接打破了成年动物神经元不能分裂再生的传统观念,带来了神经科学的重大变革。1998年,Thomson等[2]成功地建立了世界上第一株人类胚胎sc(ESCs)系,并证实其在体外可分化成包括神经元在内的各种类型的细胞,极大地推动了人类sc的研究进程。既往人们一直认为,中枢神经系统的神经元再生在出生前或出生后不久即停止。但晚近的一系列研究表明,在哺乳动物由位于脑室腔表面的胚胎神经上皮细胞组成的脑室下区(subvenuicular zone, SVZ)以及海马、嗅球等处均存在着神经干细胞[3]。并且证实这些神经干细胞在细胞因子、激素或环境因素的调控下能在体外分裂。并可进一步分化为神经元或神经胶质细胞,发挥相应的生物学作用。近些年来研究证实在人的中枢神经系统内也存在NSCs[4]。这些发现的意义在于改变了过去人们对于神经系统不可再生的认识,并促进人们对神经系统再生机制和疾病治疗的深入研究。

神经干细胞是一类能自我复制,并具有分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多向分化潜能的神经前体细胞。其特点主要有:(1)增殖能力处于较原始的未分化状态,无相应成熟细胞的特异性标志。(2)具有自我维持和自我更新能力,经对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞,另一个为祖细胞,后者在特定条件下分化为多种神经细胞。(3)具有多向分化潜能,在不同细胞因子环境及其他条件下,可以分化成不同类型的神经细胞,损伤或疾病等也可以刺激神经干细胞分化[5]。总之,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。

2 神经干细胞的来源

目前,神经干细胞的来源[6]主要有:(1)由胚胎干细胞诱导分化得到的神经干细胞。胚胎干细胞来源于早期胚胎,它在体外既可维持不分化而无限增殖,又能参与胚胎发育分化为各种类型细胞和组织而形成器官,因此被称为多潜能性细胞。可对它诱导分化而得到神经干细胞,这是发现成年神经干细胞前较为主要的来源。(2)通过肿瘤组织或转基因技术得到的永生化的神经干细胞。正常情况下,神经干细胞经多次培养所能得到的细胞数量是有限的,这主要是因为端粒在染色体的反复复制过程中减少,但是经过基因转染后可以以保持DNA复制过程中的完整性,即干细胞可以以永生[7]。(3)从胚胎或成年哺乳动物中枢神经系统分离得到的神经干细胞。现在认为,成年哺乳动物中枢的神经干细胞主要存在于海马齿状回(DG),嗅球(OB)和纹状体的脑室下区[8]。虽然神经祖细胞的确切起源尚有争议,有可能来自室下区、室管膜细胞或室下星形细胞,但它们都可以是神经元祖细胞。由于神经干细胞的来源不同,它们的生物学特性也不尽相同,移植后对脊髓损伤的修复效果亦不同。

3 神经干细胞的分离纯化方法

目前建立起的神经干细胞的分离方法有:(1)反复传代法。这种方法步骤比较多,时问长,得到的细胞纯度不高。取3~4个月龄的人胚胎纹状体或孕14~16 d小鼠、大鼠胚胎大脑,机械分离制作单细胞悬液。在含多种神经因子的无血清培养基中培养,经过长期培养反复传代可使神经干细胞得到纯化。(2)流式细胞术。这种方法所需要的仪器设备昂贵,并且存在纯度不高、技术要求高和影响细胞活力等缺点。Sasaki等[9]采用流式细胞仪对约60种细胞表面抗原进行筛选,结果发现分选出的具有CD133+/CE34+/CD45+(细胞表面抗原)的细胞为神经干细胞。(3)免疫磁珠细胞分选法。利用磁珠表面的特异性抗体与神经干细胞表面抗原结合,在磁场作用下使结合磁珠的神经干细胞与其他细胞分离,从而得到纯化的神经干细胞。这种方法具有省时、简便、分离纯度高和分离容量大等优点[10]。近年来,国内已成功地利用这种方法分离纯化神经干细胞。

4 影响神经干细胞增殖、分化的因索

4.1 增殖的调控因素

神经发育的早期是干细胞增殖的主要阶段。在这个阶段,干细胞要通过10~20次分裂进行增殖,为后期的神经元发生和胶质发生做好准备。此外在一些特定的发育阶段,机体也可通过选择性细胞分裂的方式,弥补损失的细胞,进行组织修复。不管是发育时的增殖还是损失后的再生,都需要相应的机制进行调控,最近的研究已发现一些调控细胞分裂的因子和途径。 

(1)生长因子家族:如成纤维细胞生长因子(FGF),表皮生长因子(EGF)等,单独使用表皮生长因子可使神经干细胞表达Nestin的时间延长,并促进神经干细胞向星形胶质细胞分化;单独使用成纤维细胞生长因子-2可增加微管相关蛋白阳性细胞数量,即促进神经干细胞向神经元分化。另外,血小板源性生长因子(PDGF)可提高神经祖细胞的存活,使成纤维细胞生长因子-2增殖的干细胞生成神经元的比例从50%增至80%;睫状神经营养因子(CNF)促进神经干细胞几乎完全向星形胶质细胞的方向分化,脑源性神经生长因子(BDGF)和胰岛素样生长因子(insulin growth factor, IGF)可通过上调转录因子Bn-4使分化的神经元增加4%~5%。Wright等[11]的研究表明,白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor,LIF)能够通过基因水平直接或间接地影响神经干细胞的增殖,可以使其传代110代,他们发现撤去白血病抑制因子后有200多种基因的表达水平显著下降。对鼠的生长发育研究发现,在孕8.5d时,成纤维细胞生长因子及其受体就在脑内出现,而表皮生长因子及其受体需到孕11d才出现,这表明在发育的早期,成纤维细胞生长因子起主要作用。如果成纤维细胞生长因子及其受体缺失,将造成干细胞的增殖显著减少。随着发育的进行,更多限定性的前体细胞则需要相应的生长因子,如胶质前体细胞需要血小板源性生长因子和表皮生长因子[12],而神经元前体细胞则需要成纤维细胞生长因子和神经营养素3 (NT-3)等。另外,研究表明成纤维细胞生长因子-2,表皮生长因子和转化生长因子(TGFα)不仅在发育中的中枢神经系统中广泛表达,而且也是目前所知能在体外促使前体细胞增殖的配体。

(2)细胞黏附分子(CAM):是调节干细胞行为的另一类信号蛋白。神经祖细胞以表达不同的整合素(integrins)。当其结合细胞外基质蛋白或位于其他细胞表面时,可激活细胞内信号转导通路的PI3和Akt激酶从而引起增殖。有实验显示,增殖时需要α5b1整合素的活化[13]。神经递质如谷氨酰胺和γ氨基丁酸(GABA),也可以调控干细胞的数量。(3)受体耦联的信号转导通路:此转导通路对于细胞循环周期的影响机制也是目前研究的热点之一,多种级联的信号转导参与其中。在最近的研究中发现,ras/raf/erk蛋白激酶通路在增殖的调控中比较要。干细胞高度的自我复制能力有赖于necdin表达时高水平的P107/E2F1/2/3的存在[14]。   

大部分的分裂细胞遵循Haynick限定,即只在一个限定的阶段对增殖信号有应答,而过了这个阶段,尽管仍旧暴露在该环境中,细胞将不再进行增殖,而是转向分化,最终经历衰老或凋亡。但也有例外,如胚胎干细胞(ESC)等就不遵循这一限定,它们可以不断进行复制,这可能与端粒及DNA修复酶复合体(包括端粒酶、RNA依赖的DNA多聚酶)的表达程度有关。

此外,近几年的研究表明,骨形态发生蛋白(BMP),wnt及Hedgehog生成素均是有丝分裂原,它们可以诱导各自所诱导的细胞增殖。Pax6,Emx2,IAx2和Foxg参与皮质相应区域干细胞的增殖和定型。Foxg1能抑制随后的分化程序等。

4.2 影响神经干细胞分化的因索

(1)细胞因子的调控作用:Belicchi等[15]将AC133+表皮源性干细胞注入成年大鼠脑组织内,发现在表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用下,它可以分化为神经元和星形胶质细胞,但很少形成少突胶质细胞。而纯化的AC133-干细胞则分化为成熟的神经元和大量的星形胶质细胞,且分化的星形胶质细胞主要围绕前脑皮质血管生长。Hitoshi等[16]以体外克隆神经球法分析细胞因子对神经干细胞分化的影响,发现碱性成纤维细胞生长因子在胚胎早期干细胞增殖过程中发挥作用,促进其分化为神经元;而表皮生长因子在晚期干细胞增殖过程中发挥作用,促进其分化为星形胶质细胞。Johe等[17]发现血小板源性生长因子可促进神经干细胞分化为神经元,睫状神经营养因子可促进干细胞分化为星形胶质细胞,甲状腺激素T3可促进干细胞分化为混合胶质细胞。另外,有研究表明,胶质源性营养因子(GDNP)家族可促进肠神经系统的发育和外周感觉神经发育,神经生长因子(NGF)家族可促进表皮生长因子反应性海马、室膜下带神经干细胞的存活和分化。Kuai等[18]报告,维甲酸和神经生长因子是定向诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的常用因子。用含维甲酸的培养液对胚胎干细胞进行贴壁培养,可高效重复地分化出神经和微管蛋白,诱导得到的神经细胞有钠、钾离子通道的特征。

目前认为,不同种类的细胞因子、同一细胞因子的不同浓度,以及多种细胞因子组合对神经干细胞的分化作用各不相同。在神经干细胞分化的不同阶段,相同的细胞因子的作用亦不相同。通过在分化的不同阶段筛选定向分化作用最佳的细胞因子或探索细胞因子组合的最佳方案,在一定程度上可提高神经干细胞定向分化的比例[14]。

(2)基因的调控作用:首光需要强调的是神经干细胞能在体内沿着既定路线增殖发育成为各种神经细胞,主要归因于基因的调控。Hermanson等[19]认为,CO抑制性核受体(nuclear receptor CO-repressor, N-CoR)对神经干细胞的分化起抑制作用,是主要的调节因子。他发现,用成纤维细胞生长因子-2处理过的N-CoR基因破坏的胚胎皮质祖细胞自我更新能力受损,同时自发分化为星形胶质样细胞。Zhong等[20]发现,小鼠的numb基因调控神经干细胞的非对称分裂,而仅靠加入的一种或几种细胞因子很难得到特定的目的神经细胞。要解决定向分化的问题,仍须从基因水平进行调控,因此必须明确分化中主要调控基因的种类和性质,特别是分化不同阶段中决定分化方向的主要基因,以便确定研究中需要激活或沉寂哪些基因。分化细胞与祖细胞、激活细胞与静止细胞、突变细胞与正常细胞之间都存在基因的差异性表达,若能在这些细胞群中找到差别表达的基因,就可以通过转基因的方法来调控神经干细胞的分化方向。已有研究证明,将多巴胺烃化酶基因导入神经干细胞中,通过诱导分化,可以得到多巴胺神经元[21]

另外,Blackshaw等[22]对神经干细胞移植后的分化进行了大量的研究,结果发现神经干细胞因其移植位置不同或细胞之间的相互作用而出现不同的分化。比如,将神经干细胞移植到脊髓后得到的5096个神经元都是胆碱能神经元,而移植到海马得到的几乎都是γ氨基丁酸能神经元,移植到大脑皮质产生的神经元中,谷胺酰胺能神经元与γ氨基丁酸能神经元的比例接近2:1,后二者中几乎未得到胆碱能神经元。Mikami等[23]将树突状细胞植入损伤的大鼠脊髓内,发现损伤的脊髓功能得以恢复。离体实验表明,树突状细胞的作用在一定程度上类似于抗原,能起营养作用,激活内源性神经干细胞的有丝分裂,从而修复脊髓损伤。

5 神经干细胞的应用

神经干细胞具有自我复制能力,同时动物实验证明,移植的神经干细胞有迁移能力,能远距离弥散到病变部位,同时能整合于宿主组织,一般又无排斥反应。神经干细胞替代治疗就是利用这一特点,通过体外培养扩增神经干细胞,再移植到脑内,以替代因损伤或疾病而丢失的神经细胞,从而达到治疗的目的。这类治疗方法具有以下特点:(1)神经干细胞在中枢神经系统中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型,其形态功能与附近原有细胞十分相似。(2) NSCs为“免疫豁免”组织,植入的NSCs不对宿主的免疫系统构成刺激,宿主对移植的NSCs不产生排斥反应[24],这大大增加了用作移植的神经干细胞的来源。大量动物实验证明神经干细胞替代和部分重建神经回路是可能的。目前,神经干细胞移植在实验上已经应用于帕金森病、癫痫和脑坏死等鼠类和灵长类动物模型,并积累了大量的实验资料。Nagai等[25]曾以基因转染的方法得到永生化的人类神经干细胞。近来他们以逆转录病毒为媒介将v-myc基因导入人胚胎前脑细胞,从而得到了更多的人类神经干细胞系的永生化克隆。其中HB 1/C4系比较稳定,携带[beta]-gal基因,将其植入帕金森病大鼠模型和髓磷脂变异的颤抖大鼠脑内,手术后2~6周,可见植入的细胞迁移广泛,并融入宿主脑内,分化为神经元和(或)胶质细胞,取得了很好的疗效。Kim等[26]研究了黏多糖蓄积病,将体外培养的神经干细胞移植到大鼠模型的大脑内,取得了很好的效果。脑缺血坏死患者植入NT2/D细胞系(来源于神经元性畸胎瘤)后,功能也有所改善[27]

将HiB5细胞和取自小脑的干细胞分别移植于新生鼠的海马及小脑,可发现这些移植细胞能存活并分化为与移植部位相对应的细胞[28]。同时发现HiB5细胞在海马齿状回及小脑皮质能够分化成具有内源性粒细胞特征的神经元,被植入到内粒层、分子层及白质区域的干细胞所分化细胞的形态分别与粒细胞、星形细胞和少突胶质细胞的形态相似。在22个月后发现干细胞产生的神经元与宿主的神经纤维建立突触联系,移植细胞的分化表型由移植部位的局部特征性信号决定。因而干细胞可从解剖和功能上修复受损脑组织。近年研究发现,原代神经干细胞也可以直接用于神经细胞移植,将碱性成纤维细胞生长因子扩增的成年鼠干细胞移植到成年鼠的海马中,3个月后仍可见大量存活的细胞,在齿状回中存活细胞分化成与宿主神经元相似的神经元。神经干细胞不仅修复神经元缺失而且可以修复损伤的神经胶质[29]。干细胞移植能有效地治疗广泛性神经退行性变。例如,将神经干细胞注入基因脱髓鞘模型胎鼠脑室中,症状改善,目病理检查有明显的改变。移植的神经干细胞能在脑内广泛的迁移,融合进宿主的细胞结构,并可在接下来的发育阶段矫正脱髓鞘过程。植入的神经干细胞潜行替代因损伤而丢失的细胞,重建神经环路,并在损伤部位上方或下方建立中继站。而目,脊髓内的干细胞能通过基因调控提供治疗因子,从而防止细胞死亡并促进再生。

经干细胞和祖细胞移植与基因治疗为脊髓损伤的修复提供了广阔的前景,其中最有希望的是神经元限制性祖细胞。此类细胞能在体外扩增并具有分化成为大量神经元细胞的潜力,包括运动神经元。在离体基因治疗的调节中,治疗基因被引入培养细胞,然后将这些细胞植入到脊髓损伤部位,初步观察证实植入的细胞在脊髓损伤部位可以存活1个月以上。

Akiyama等[30]通过从成年人的脑室下区和海马中分离获得人类成体神经干细胞,经体外扩增后植入成年大鼠脊髓后索脱髓鞘的脊髓损伤模型中。移植后3周,可见后索脱髓鞘区出现广泛的髓鞘再生现象;光学显微镜下观察显示,再生的髓鞘与雪旺细胞形成的髓鞘十分相似,细胞免疫组织化学染色,髓鞘再生区域可见外周髓鞘特异性蛋白PO免疫反应呈阳性;电子显微镜观察可见再生髓鞘外有基底膜结构,证实移植的神经干细胞在体内分化为雪旺细胞样细胞并使脱髓鞘区域髓鞘再生;电生理检测髓鞘再生区域的电位传导波形发现,其延迟期与正常对照组类似,波形亦基本正常,说明髓鞘再生区域轴突的电传导速度基本恢复正常。这些研究结果表明,人类神经干细胞是拥有巨大潜力的移植材料,对中枢神经系统损伤具有良好的修复作用。

6 存在的问题

虽然,干细胞移植治疗中枢神经系统损伤有潜力.但是日前仍然存在一些问题。如:(1)干细胞是如何到达病变部位的?(2)何种信号刺激干细胞发生了分化[31](3)日前人们多是根据细胞形态和细胞特异性表而标志来判断成体干细胞的分化但至今还没有充分证据表明这些分化的细胞也具有相应的特定功能[31]。(4)干细胞发育途径上,究竟哪一阶段的祖细胞或成体干细胞最适于移植?(5)怎样才能提高移植细胞与宿主细胞的整合程度?(6)怎样才能延长移植细胞的存活时间及提高增殖能力?(7)怎样才能避免移植的干细胞恶变的可能[32] ?

7 应用前景

对许多难治性疾病而言,细胞移植无疑是一种行之有效的方法。神经干细胞研究虽然较晚,但却是当前研究的热点。这既与每年有大量的因脑、脊髓外伤而致功能缺失严重影响生活质量有关;也与人类社会正在逐渐进入老年化有关,因一些老年性疾病,如老年性痴呆症、帕金森病、卒中等在人类疾病构成中显得越来越重要,这些疾病一般都伴有脑或脊髓相应部位的特定神经元死亡。目前用胚胎干细胞或神经干细胞、骨髓间质干细胞治疗这些疾病,在动物实验中已初步见效。有理由相信,随着广大科学工作者的不懈努力,成功地应用干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的曙光一定会到来。

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