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RNA干扰技术及其在各个研究领域的应用
2009-06-15 16:57   发布范围:公开

口腔医学系  7队  杨  乐

【摘  要】 随着1998 年作为一项在分子生物学及细胞生物学研究的新技术得到了快速发展。该文就近几年来RNA 干扰的机制以及在寄生虫等方面的研究进展作一综述。

【关键词】 RNA;双链RNA;干扰;寄生虫;遗传;临床医学


0 引言

RNA干扰(RNA interference ,RNAi) ,全称为双链RNA介导的干扰,它是由美国卡耐基研究院的Fire等于1998年发现的一种现象。从发现至今短短数年,尤其2001年以来,RNAi迅速发展成为一项在分子生物学及细胞生物学研究中最具广泛用途的新技术。该技术以其高特异性、高效性、成本低廉等优点而成为研究基因功能和治疗某些疾病最有前途的技术之一。

1  RNAi

1998 年,Fire等在研究反义核苷酸时,发现将dsRNA 注射到线虫体内能有效地抑制有互列源性基因,而且抑制效果较单链反义RNA好;如果注射无关dsRNA,则不能产生抑制效应,这就表明dsRNA的抑制效应是特异的,因此提出了dsRNA诱导的RNAi。随后的研究发现,RNAi就是自然存在于植物中的抗病毒机制[1]。dsRNA诱导的RNAi是通过特异地降解有同源序列的基因产物mRNA而完成的。因此,称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing , PTGS)。这过程中,dsRNA先处理成为21~23 个碱基的小RNA 才能诱发RNAi。因此,称这类小RNA为小干扰RNA( small interfering RNA ,siRNA)。参与此过程的核酸内切酶是核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)- Dicer。siRNA 与解螺旋酶、核酸酶等结合形成RNA 诱导的沉默复合(RNA inducing silencing complex , RISC)。由siRNA引导RISC与互补mRNA结合,将mRNA降解。在低等真核生物中可能还存在siRNA的放大过程。以siRNA作为引物,互补mRNA为模板,在RNA依赖性RNA 合成(RNA-dependent RNA Polymerase ,RdRP)的作用下,合成新的dsRNA。再由Dicer核酸内切酶处理为新的siRNA。尽管dsRNA在植物和果蝇细胞中能诱导RNAi,将dsRNA转入常用的培养哺乳细胞内(如人胚肾293细胞、小鼠成纤维细胞NIH 3T3等) 未引起特异、有效的RNAi现象;在改用21个碱基的小RNA转染细胞后,可以在哺乳细胞内引起特异的RNAi现象[2] ,这使RNAi技术应用于人类成为可能。目前,有两种方式在哺乳动物细胞内诱导RNAi:利用传统的转染、电打孔法等将化学合成的siRNA导入细胞,此法简单、快捷,只是引起的RNAi效应往往是暂时的,难以持久;另一种方法是在哺乳细胞内表达siRNA ,来维持长久的、可诱导的RNAi效应[3]

2  RNAi 的作用机制

RNAi的作用机制目前还不是完全清楚,但是两种基本作用模式最近得到实验证明。

2.1 第一种模式:DicerSlicer依赖模式

这种是人们用果蝇胚胎细胞及培养细胞S2为研究对象发现的,它主要包括四个步骤: ①长的dsRNA 在导入细胞后,首先被剪切为长度21~25 核苷酸的双链:RNA小片段(SiRNA)。在这一步骤中,Dicer参与对dsRNA的剪切作用。Dicer是RNaseⅢ家庭的一个成员,属特异性双链RNA核酸内切酶。Dicer对RNA的剪切作用依赖于ATP。②SiRNA与一种蛋白复合物相结合,这种蛋白复合物含有一个SiRNA和一个蛋白核酸酶分子。目前,这种酶分子已被分离纯化,实验证实也不同于Dicer,有人将它命名为“Slicer”。与SiRNA 结合的复合物还不具有活性。③在SiRNA的指导下,蛋白复合物形成了一种有活性的RNA的诱导的基因沉默复合物(RNA2induced silencing complex ,RISC) 。④在少量或没有ATP参与的情况下,RISC识别与SiRNA具有同源互补序列的靶RNA,并对靶RNA进行剪切,产生RNAi作用。

2.2 第二种模式:“随机降解PCR”模型(random degradation PCR)

这种模式的作用机制与一种名叫RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases , RdRPs) 有关。RdRPs不仅可以扩增dsRNA ,同时也可以扩增SiRNA。“随机降解PCR”模式的作用机制是:RdRP利用SiRNA链作为引物,以靶RNA作为模板来合成新的双链RNA。合成的双链RNA分子距离被Dicer水解,被Dicer水解释放出的新的SiRNA又可以作为引物指导新一轮的dsRNA合成、降解。人们在果蝇、真菌、线虫等细胞内均检测到这种RdPR的活性,但在人类细胞中,还未见有类似报道[4]。“随机降解PCR机制”对线虫类的RNAi作用更重要,通过这种机制产生的RNAi在各类线虫体内均存在,而且可以遗传几代以上。

3  RNAi的应用

高通量研究基因功能:已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。双链RNAi干扰技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的表达,而且也可抑制体内特定基因的表达。在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。21nt siRNA的双链复合物在哺乳动物细胞中干扰成功为基因作用的研究提供了一种新的工具。将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方式由同一启动子控制表达,这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA,产生RNA干扰,使目的基因静默,从而可进一步研究目的基因的功能。

研究信号转导通路的新工具:由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达,其成为研究信号传导通路的良好工具。联合利用传统的缺失突变技术和RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系。RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点。因此RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。

基因治疗的应用: RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术,在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。

3.1 RNAi技术在寄生虫学研究中的应用

寄生虫功能基因的研究 研究基因功能的传统方法是突变体的筛选,后来发展出反义核苷酸技术、核酶技术、基因敲除技术等。RNAi技术作为一种研究基因功能的新方法,具有特异性强、周期短、用量少、来源较容易、操作简便等优点,已成功应用于多种寄生虫功能基因的研究。有许多基因进行RNAi后并不造成可观测到的形态、行为或发育方面的变化,例如秀丽新小杆线虫染色体Ⅰ基因进行RNAi后,只有14 %的基因产生可观测的变化[5]。这可能是因为①RNAi对靶基因的抑制率不能达到100 %(目前实验用RNAi效应分子对基因的抑制效率达到70 %即可) ,少量靶基因的表达仍可维持生物体基本的生命活动;②生物体具有系统性很强的复杂的生命活动过程,某一蛋白的表达受抑制后,有可能激发其它补偿途径,从而维持正常的生物学效应。

3.2 RNAi在医学遗传病研究中的应用

3.2.1 肌肉营养缺乏症

果蝇与线虫中的基因可利用RNAi敲低模拟突变体功能丧失,以阐释许多肌肉功能丧失疾病的发病机制,这些退化性疾病是以机体肌肉进行性瘫痪,最终过早死亡为标志的。儿童中严重的杜兴氏肌营养不良(假性肥大型肌营养不良,DMD)会导致心血管异常,致使该病患者平均死亡年龄在25.3岁或者更小[6]。在线虫中存在肌营养不良基因( Dys21) 的同源基因,用RNAi 敲低后,会出现类似dys21中的表型。人类的同源基因( DMDP186) 也存在于果蝇中,其功能及其相关基因也是通过RNAi获取到的。小鼠的DMD 模型还没有建立。RNAi可以提供基因表达的双向调控。例如,一个编码蛋白质的基因和一个直接抗该基因的shRNA可以分别置于可诱导的启动子之下调控,转到相同细胞中。这可以应用到线虫中完成穿膜钙流的双向调控,以试图解释DMD中细胞内钙离子浓度的提高。Egl219是线虫体内钙通道。Mariol和Segalat[7]将钙门功能突变以增强信号,并用RNAi 敲低EGL219 来降低它。钙信号增强会引起肌肉退化的增强,这可以靠RNAi敲低EGL219 来封闭。很显然RNAi 可以广泛地在线虫和果蝇中应用于该疾病的研究。人类中X 连锁的Emery2Dreifuss肌营养缺乏症是由伊默菌素的功能丧失引起的。在线虫中与伊默菌素同源的基因是EMR21 ,RNAi敲低EMR21后,在线虫任何发育期都检测不到病症表型。这表明EMR21 丧失的功能被另一个途径补偿。用RNAi敲低MAN21 会引起15 %的胚胎致死,但在缺乏EMR21的情况下,MAN21敲低会引起全部胚胎致死,这说明EMR21 与MAN21在功能上有重叠,因此,可以通过基因置换提供Emery2Dreifuss 肌营养缺乏症的治疗方案。

3.2.2    脊柱肌肉萎缩症(SMA)

SMA 是因为运动神经蛋白(SMN) 的突变引起脊索中少量的运动神经元缺失而致,但是不清楚为何SMN的丢失与神经元的死亡相关。SMA的线虫、果蝇和小鼠模型也不断出现,线虫里有SMN的同源物,泛素化表达。利用RNAi敲低SMN会引起胚胎存活能力的降低和严重的纵向运动失调。酵母双杂交实验结果表明,线虫SMN蛋白之间的相互作用与人类相似。果蝇一直用作该疾病的动物模型,其SMN基因定点突变会引起不正常的运动行为和神经元功能损伤,并改变突触传递[8]。SMN的RNAi抑制会引起果蝇S2细胞凋亡[9],该效应可以靠caspase抑制子(Z2VAD2fmk)逆转,表明RNAi是一个可行的、有针对性的治疗方法。在小鼠模型中,SMN的基因删除后是致死的,但SMN + / - 杂合小鼠存活,可达到46 %的SMN降低,并且出现运动神经元退化,近似于脊柱肌肉萎缩3型, 近来在小鼠P19细胞系中SMN表达敲低效果很好,表明SMA 的小鼠模型也是可利用的。

3.2.3  综合征(fragile X syndrome)

脆X综合征是可遗传的人类智力低下疾病,这与脆性X智力低下基因( FMR1)的表达量低或者无表达相关。患者有FMR21基因5′2 非翻译区遗传不稳定的CGG重复序列扩增和5′2 端CpG岛异常甲基化现象。有研究报道,脆X综合征可以被认为是天然RNAi 机制运行失调引起的一类疾病。现有该疾病的小鼠[10] 、线虫[11]和果蝇[12]模型。

3.2.4  阿尔茨海默病

阿尔茨海默病与淀粉样蛋白(Aβ)的不溶性颗粒堆积相关,同时,从基部前脑到海马体和扁桃体运输的胆碱能神经元丢失。颗粒沉积是γ2分泌酶使Aβ过量产生的结果。现在仅有该病的线虫模型,用来表达人类Aβ多聚肽的基因工程线虫株已经建立[13,14]。该模型可用于确定Aβ异源性表达引起的上调和下调基因,对寻找调节Aβ分泌的基因十分有利。在该病的线虫模型中,Aβ仅表达在肌肉中。所以必须改善阿尔茨海默病的无脊椎动物模型,特别是建立在神经系统中表达并分泌人类Aβ的线虫模型。表达淀粉前体蛋白(APP)的阿尔茨海默病的果蝇模型正在建立。RNAi应用到果蝇细胞系为阿尔茨海默病的研究提供了潜在的有力工具。早期可遗传的阿尔茨海默病与presenilinsPS1和PS2突变有关,会引起Aβ的过量分泌。果蝇具有与脊椎动物presenilins PS1和PS2(PSN)相似的同源物,PSN的RNAi敲低会引起γ2分泌酶活性的阻断,能够确定该基因在γ2分泌酶途径中的作用。现已应用于果蝇的S2细胞中。α2分泌酶裂解中期的前体蛋白可以消除γ2分泌酶引起的阿尔茨海默病中的Aβ水平增强,但目前尚不清楚α2分泌酶的性质。在人的神经胶质瘤A172细胞中,利用RNAi敲低技术证明3种ADAM蛋白(ADAM9、ADAM10 和ADAM17)都会影响α2分泌酶活性。哺乳动物的应用也为确定介入治疗的靶基因以治疗阿尔茨海默病提供了很有前景的治疗方案。

3.2.5  poly(Q) 疾病

poly(Q)疾病是由于CAG三核苷酸重复导致的。最近RNAi技术已被应用到两种常见的poly(Q)疾病--Huntington疾病(HD)和spinobulbar muscular atrophy (SBMA)。HD是常染色体遗传病,该病发展迅速而且致命。Huntingtin基因突变会引起无意识的运动(舞蹈病),导致认知能力损失并出现一些诸如沮丧、焦虑等生理上的问题[15]。HD是由于Huntingtin基因外显子1中存在CAG三核苷末端poly(Q)的长度,导致神经元核内包涵体的形成和聚集。SBMA是X连锁运动神经元疾病,在成人中发病。正常人体中有11到35个poly(Q)重复,而在SBMA个体中则因男性荷尔蒙受体(AR)的外显子1中CAG三核苷酸重复,出现38到62个poly(Q)重复,导致正常表达AR基因的组织中AR核内堆积,而脊髓和脑干中AR含量降低。有些研究者将表达poly(Q35)的重复序列与黄色荧光蛋白融合构建转基因菌株,进行RNAi的筛选,确定了能够引起非成熟化蛋白堆积表型的186 个基因。这些基因主要是参与RNA新陈代谢、蛋白质合成、蛋白质折叠、蛋白质降解和蛋白质运输等过程。表达部分人类ar基因的Drosophila S2细胞基因工程株已经建立,该基因带有绿色荧光蛋白标记的26个、43个或106个CAG示踪。其中带有43个和106个CAG重复序列的细胞中表现为GFP堆积,而且后者明显高于前者。用RNAi直接抗AR蛋白,有80 %共转染的S2细胞中不出现AR蛋白GFP堆积。因此,RNAi在治疗poly(Q)神经退化病上是很有潜力的。

3.2.6  帕金森疾病

帕金森疾病是由多巴胺神经元丢失引起的,该病与Parkin的过量表达相关,Parkin的过量表达会降解其底物(Pae12R)并抑制它的毒性,同时干扰激发底物堆积和增高底物毒素的内源性Parkin生成[16]。RNAi将在解释帕金森综合征分子机制方面起到很重要的作用。病毒介导的RNAi一直用于成鼠中脑神经元多巴胺系统封闭。腺病毒载体中的U6启动子启动抗酪氨酸羟基酶的shRNA的表达,该酶是产生多巴胺必需的。将抗酪氨酸羟基酶的shRNA 注入到大脑的黑质中,经多巴胺染色分析,多巴胺含量比对照侧降低。仅30 %~40 %蛋白敲低就使成鼠表现出启动行为的丧失和旋转测试中运动能力的降低,类似于最初建立的毒素诱导的多巴胺神经元丧失的模型,说明RNAi诱导的多巴胺系统敲低会建立合理、真实的帕金森疾病模型。

3.2.7  遗传性痉挛截瘫

遗传性痉挛截瘫是一种神经全面破坏的疾病,呈现濒死状态,最终会引起轴突退化。人体中大约有20 多个基因与该病相关,但是40 %的病例中都会有基因SPASTIN(SPG4)的突变。Spastin是一种ATP酶,与许多细胞活性蛋白家族相关,并与微管和细胞器转运区相互作用。在果蝇中利用转基因方法过量表达和采用RNAi方法敲低均可在体内揭示Spastin的作用。Spastin RNAi会引起神经肌肉连接处形态发育不全,突触域减少。果蝇中Spastin(D2Spastin) 过量表达会降低突触数量,然而Depastin RNAi提高了突触流。同时明,Despastin的缺失会引起神经细胞中微管的不稳定,在突触生长和神经传递上都有缺陷。spastin相关的HSP(hereditary spastic paraple2gia)疾病会引起神经无功能,这一发现将为HSP提供治疗靶标,并为发现与微管无功能相关的神经性疾病提供理论线索[17]

3.2.8  Ⅰ型多样性内分泌瘤

Ⅰ型多样性内分泌瘤是常染色体显性肿瘤综合征,在副甲状腺、胰腺和前垂体中均会出现。定位在染色体11q13上的肿瘤抑制子基因MEN1,表达产物Menin在许多物种中都保守存在。在研究人和鼠中Menin表达调控时,检测了第二个外显子上游1kb区对启动子活性的影响,该启动子位于第一个外显子的上游。1kb区可以调节启动子活性,过量表达的Menin可以下调临近的启动子活性,利用RNAi下调MEN1 ,调节区代偿性激活启动子。说明MEN1基因表达靠它的产物Menin来反馈调节,揭示了Ⅰ型多样性内分泌瘤的分子发病机制[18]

在临床医学中的应用

4.1  RNAi与血液学

Bruton氏酪氨酸激酶(Btk)以及其他蛋白酪氨酸激酶家族的成员在各种造血细胞中有不同表达,在免疫受体信号转导中起关键作用, RNAi就有助于这些激酶的功能研究。用RNAi技术抑制Btk时可引起RBLO2H3肥大细胞释放的组胺量下降,证明在过敏反应时,Btk对组胺释放有直接作用[19]。胆红素从生理意义讲是一种抗氧化剂,有保护细胞的作用。通过RNAi介导的胞内胆红素含量减少,可使细胞对氧化剂的反应性显著增强,最终导致细胞死亡。由于临床上很多血液病是由于基因突变或基因功能丧失引起的(如丙酮酸激酶缺失症、球形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸酶缺失症、血红蛋白病等) ,因此利用RNAi技术可以建立这些疾病进程的体内模型。相信RNAi介导的血液病模型有助于发现具有开发价值的新的药学靶点或寻找到基因治疗方面的效应靶点。

4.2  RNAi与肿瘤学

在该领域中,早期运用RNAi技术主要针对的靶点是突变癌基因、已扩增的癌基因、易位产物和病毒癌基因。而且, RNAi为研究确定肿瘤发生中起作用的新型信号传导分子如PLK 提供了方便。针对K562细胞中融合癌基因BCR/ABL的RNAi产生了令人鼓舞的结果。两位学者在各自的实验中,使用定量RTOPCR和Western blot检测发现RNAi可以有效降低BCR /ABL mRNA和癌相关蛋白产量。最近发现在人白血病细胞系SKNOO1中,AML1OMTG8的易位也可通过RNAi来抑制。该基因受抑制后,可观察到细胞形态变化,对TGFOβ1/维生素D3诱导的分化的敏感性增加,由此阐明了AML1OMTG8有阻止细胞分化的作用[20]。所以选择该融合基因作靶点,为寻找杀死肿瘤细胞的新途径提供了线索。在使用反义DNA寡核苷酸进行肿瘤治疗的Ⅰ/Ⅱ期研究失败后,人们针对普遍存在的突变癌基因使用了RNAi。人类癌症中Ras基因经常突变,这使其成为一种难以被靶向的癌基因。Brummelkamp等使用RNAi逆转录病毒系统成功的抑制了KORas在人胰腺癌细胞中的表达, 并导致该细胞丧失成瘤性。而且,该干扰效应选择性的抑制突变KORas而非野生型证明RNAi的特异性能满足基因治疗的要求。随后,用RNAi对抑癌基因PML或早幼粒细胞白血病基因的研究揭示, PML和MHC类分子表达之间没有调节关系。对PML进行抑制,并没有出现MHC类分子会下调这种假想结果,因此提示,存在着另外的可以使急性早幼粒白血病细胞逃避免疫监视的途径。病毒癌基因是RNAi介导的肿瘤治疗的另一类潜在靶标。通过对HPV阳性的宫颈癌细胞的研究,表明用siRNA可使HPV的E6和E7基因表达持续沉默,这是首次发现在哺乳动物细胞中外源性病毒基因可被抑制。因此,选择性的抑制被致癌病毒感染的细胞是可行的。RNAi介导的病毒抑制不会阻碍细胞内在的调控系统工作,细胞仍然有表达其它基因和进行凋亡的能力,这一点有至关重要的生物学意义和临床使用价值。提高化疗和放疗对肿瘤细胞的效应是RNAi另一潜在应用价值。已知DNA双链断裂修复功能的缺失可使细胞对电离辐射高度敏感。Prkdc是一种编码依赖DNA的蛋白激酶催化亚基的基因,这种亚基在DNA修复时有整合作用。Peng等[21]在人成纤维细胞中针对Prkdc 进行干扰,结果显示细胞对放射的敏感性增高,尤其是在0~3.7×1010 Bq的低剂量时也是如此。RNAi 还可用于研究与异常信号通路有关的能导致肿瘤发生的转录因子。核转录因子CREB在活动性白血病病人骨髓中的过度表达被认为与白血病发生有关,有实验表明:转染CREB siRNA能导致白血病细胞K562和TFO1的生长和存活数量减少。CREB siRNA也能抑制人胚肾细胞系293T生长、存活,这提示CREB在白血病和非白血病细胞中都有关键作用。

4.3  RNAi和干细胞生物学

当前,干细胞治疗是热点问题,引入RNAi技术后这个领域研究更是方兴未艾。将未分化胚胎细胞或多能干细胞作靶标,在模型动物的发育中可以看到基因沉默效应。已有人用造血干细胞(HSCs)来建立其感兴趣的鼠恶性肿瘤模型。Hemann等[22]先将针对抑癌基因Trp53的小发夹RNAs转染至HSCs,再把这种HSCs输入用致死剂量放射线照射后的老鼠体内,最后观察到了独特的肿瘤表现型,而且Trp53受抑制的程度和疾病严重性呈正相关。杆状病毒载体也许是抑制干细胞基因最有前途的siRNA表达系统。由杆状病毒表达的转基因在发育过程中会持续表达,并可用其感染胚胎干细胞或胚胎以产生转基因动物。RNAi在干细胞学中的运用使得构建缺少某种特异抗原并可用于器官移植的组织成为可能。

4.4  RNAi和感染性疾病

人类免疫缺陷病毒(HIV)一直是全世界研究的重点和热点。现在人们正利用RNAi来尝试抑制导致疾病迁延不愈的细胞因素或病毒因子。目前,用siRNA针对HIVO1 tat蛋白的方法已经成功抑制了HIVO1的复制。其他一些siRNA靶标包括非结构蛋白rev和gag基因。另一种抑制HIV的新途径是特异性抑制像CD4这样的分子表达从而阻止病毒入侵。相似的实验还有抑制人外周血T细胞上的HIV共受体CCR5以达到阻止病毒感染细胞的目的。但是,要将以上结果在体内模型中得到重复,并获得稳定抑制病毒的效果,还需要做大量工作。此后,研究者又把目标投向了HCV和HBV。HCV基因组是1条只有1个ORF的正链RNA,很适合作RNA干扰的对象。首先:先选择了针对HCVNS3和NS5B的siRNA,再将其转染到能稳定复制HCV复制子的细胞系HuhO7,然后观察到HCV的RNA复制和蛋白表达都受到了有效抑制,而且这一效应是不依赖于IFN的;紧接着,又有人证实:用RNAi针对HCVNS5A也可在人肝癌细胞系HepG2中抑制NS5A的RNA和蛋白表达,更为重要的是这种靶向作用于NS5A的siRNA还能抑制HCV核心蛋白表达。这些都为治疗HCV持续感染提供了新途径。尽管HBV是一种DNA病毒,但研究同样证明:HBV在人类HepAD38和HepAD79细胞中的复制可以特异性的受到dsiRNA的干扰。SARS病毒基因组也是一条非常稳定的正链RNA[23],我们的研究也已经为用RNA来治疗SARS提供了实验依据。呼吸道合胞体病毒(RSV)和轮状病毒对儿童危害较大,分别引起急性呼吸道感染和胃肠炎。现在这两种病毒作为RNAi的对象,在哺乳动物细胞中初步被成功干扰。Ge等[24]报道针对流感病毒核衣壳和RNA转录酶的siRNA可抑制病毒复制和阻止病毒其他RNAs发挥作用。这提示siRNA可能对预防和治疗流感起到作用。恶性疟原虫疟疾是发展中国家常见的地方病,危害严重。Malhotra等运用RNAi技术,抑制胱氨酸蛋白酶的基因falcipainO1、2的表达,以期达到治疗疟疾的目的。

展 望

人类基因组计划的完成使人们纷纷将RNA干扰技术引入这一领域进行研究。由于掌握了人类基因的全部序列,就可以利用反向基因分析的策略来深入研究人类疾病,科学家正在将RNAi应用于患有人类疾病的动物模型中,以观察其在体内的效应。RNAi不但有用于基因治疗的潜力,而且将shRNA用现有的杆状病毒载体转导入干细胞或转基因小鼠后,还可加强研究各种基因在体内具体功能的能力。尽管RNAi的详细机制尚不明确,但相信它将在基因功能的研究、人类疾病的防治和新药开发等领域展现出良好潜力并发挥重要作用。

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