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RUNX3与胃癌
2009-06-15 17:20   发布范围:公开

口腔医学系7 队   雷翠

【摘要】Runt 相关转录因子3 ( Runx3 ) 基因, 曾被命名为PEBP2αC/CBFA3/AML2 基因, 是新近发现的一种抑癌基因,属runt 结构域(Runt domain, RD) 转录因子家族成员, 参与对细胞生长和凋亡的调控。近年研究发现Runx3 与多种恶性肿瘤, 尤其是胃癌的关系非常密切, Runx3 基因表达沉默与胃癌的发生和发展有着高度的相关性, 而且也影响着胃癌的治疗效果和预后, 因而Runx3 有望成为胃癌诊断的特异性标志物和基因治疗的靶点。但目前对Runx3 的详细作用机制和调控尚不十分清楚,本篇综述就RUNX3 的结构、功能、抑癌机制以及Runx3 基因与胃癌的相关内容做一总结。

【关键词】RUNX3; 胃癌;甲基化


0 引言

人类Runt相关转录因子3(Runx3)基因是最近发现的一种肿瘤抑制基因,其失活的主要机制是高甲基化和杂合性缺失,Runx3基因可能是转化生长因子-β(TGF-β)转导通路的一个重要环节,参与TGF-β上皮细胞生长的负调控作用。近年研究发现Runx3与多种恶性肿瘤,尤其是胃癌的关系非常密切,Runx3基因表达沉默与胃癌的发生和发展有着高度的相关性,而且也影响着胃癌的治疗效果和预后。由此可见,RUNX3与胃癌关系密切。

1  RUNX3基因和蛋白的结构与功能

人类RUNX3基因位于染色体1p36.1,全长约67kb,含有P1和P2两个启动子,6个外显子和1290bp开放阅读框,两个启动子区域均含数个分离的转录起始点,RUNX3mRNA主要来自P2启动子的转录,因P2启动子中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)含量较高(64%),故在理论上其要比P1启动子易发生甲基化[1]。鼠RUNX3基因在围绕外显子2(相当于启动子P2的位置)和外显子6的起始部位有两个大CpG岛,而在人类RUNX3基因中,除此结构外,在近外显子2部位还有一个明显的CpG岛。人类RUNX3蛋白是由α亚单位和β亚单位构成的含415个氨基酸残基的异二聚体[2]。α亚单位含有128个氨基酸残基组成的RUN(RD),RD与TGF-β信号通路相关的Smad蛋白中Smad2和Smad3属于受体调控型(R-Smads),Smad4属于受体辅助型(Co-Smads),Smad7属于受体抑制型(I-Smads),它们均具有保守的N端和C端,即MH1和MH2域[6],Smad锚定受体激位于RUNX的氨基末端,介导RUNX蛋白与DNA结合和与蛋白的相互作用。α亚单位介导RD与靶DNA特殊基因序列的结合,β亚单位能增强RD与靶DNA的结合力。在哺乳动物中RUNX基因家族的产物,即RUNX1、RUNX2和RUNX3,是调控一些主要生长信号途径基因表达的重要成分,在细胞增殖和分化过程中起重要作用[4]。RUNX家族基因的变化可致某些疾病或肿瘤的发生,如30%的人类急性白血病伴RUNX1基因的改变;人类锁骨、颅骨发育不良等骨疾病与RUNX2的突变有关;脊神经节的神经发育及胃黏膜上皮细胞的增生异常与RUNX3的表达缺失或下降相关。

RUNX3的抑癌机制 

目前多数研究认为Runx3的抑癌机制与具有生长抑制和凋亡诱导因子功能的TGF-β通路密切相关。TGF-β是一种对许多发育和生理过程产生抑制作用的生长因子,其信号通路的紊乱参与众

多肿瘤的发生和发展。TGF-β激活后与具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TGF-β受体Ⅰ和Ⅱ相结合,产生异四聚体复合物(TβRC),触发细胞内信号通路,其中Smad蛋白的作用很重要[5]。活物(SARA)优先结合Smad2、Smad3的MH2域,并通过自身的FYVE域将其固定在细胞上,Smad2/3复合物被活性TβRC磷酸化激活后,与Co-Smad结合往返于细胞核和细胞质之间。研究表明,Smad复合物须在Runx3等Runx蛋白的协助下才能从细胞质进入细胞核特定的靶位点[7],而Runx3蛋白也需要在TGF-β的协助下才能由细胞质进入细胞核[8]。Runt域介导的一致性特异序列5-PuACCPuCA-3’或反向的5’-TG(T/C)GGT-3’,


而5’-AACCACA-3’似乎更常见。辅助因子CBFB与RHD之间的相互作用决定了Runx3蛋白与相应的靶基因启动子或增强子之间作用的有效性。Runx3蛋白在靶基因启动子区可与众多转录因子相互作用,从而增强或主动抑制靶基因的转录激活;对于转录沉默而言,Runx3蛋白可募集转录辅助抑制因子如Sin3A或TLE蛋白家族成员,后者与羧基末端VWRPY五肽基序相互作用。目前已知的Runx3靶基因有防御素NP-3和MDR1等,但具体的调控机制尚不清楚。

3  Runx3基因与胃癌

3.1 Runx3基因突变与胃癌

Li等应用聚合酶链反应(PCR)单链构象多态性(SSCP)法检测了119例胃癌组织,结果发现仅1例存在Runx3基因突变,突变位点位于RD域np373C-T转换,引起第122位点的精氨酸转变成半胱氨酸(R122C)。为证实该突变的意义,Guo等[5]分别将野生型和突变型Runx3基因(R122C)转染至人MKN74(Runx3-/-)细胞株和鼠E1(Runx3-/-)细胞株,结果野生型Runx3转染组MKN74和E1细胞的生长明显抑制,而突变型Runx3(R122C)转染组细胞的生长不受抑制,说明后者可使Runx3基因表达沉默。但国内的研究结论与此不同,胡胜等采用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析了该突变与我国胃癌发生的关系,结果显示在胃癌高、低发区,胃癌患者该基因的突变率与普通人群比较无显著差异,在低发区H.pylori阳性胃黏膜中,该基因的突变率也无显著增高,推测该基因突变可能不是我国胃癌高、低发区的遗传易感因素,且H.pylori感染导致胃癌形成可能无该基因突变参与。

3.2 Runx3基因杂合性缺失与胃癌:

Li等应用荧光原位杂交(FISH)法研究了15株胃癌细胞株和46例胃癌组织标本,结果在20.0%(3/15)的胃癌细胞株和30.4%(14/46)的胃癌组织中存在Runx3杂合性缺失,且杂合性缺失比例随胃癌国际抗癌联盟(UICC)分期演进而逐渐增高(P<0.01);然后以逆转录(RT)-PCR等方法对上述研究对象的Runx3mRNA表达进行检测,结果检测到杂合性缺失的3株细胞株和14例胃癌组织标本中的13例均呈现Runx3表达缺失,提示Runx3杂合性缺失与Runx3表达下调有关。

3.3 Runx3基因甲基化与胃癌

DNA甲基化在正常机体中普遍存在,并与年龄相关[13~15],抑癌基因启动子CpG岛高甲基化可使其表达受抑,与肿瘤的发生密切相关。Kim等应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测了胃癌和各种癌前病变中Runx3基因启动子的CpG岛甲基化状态,结果显示慢性胃炎甲基化阳性率为8.1%(n=99),肠化生为28.1%(n=32),胃腺瘤为27.3%(n=77),胃癌为64%(n=75)。田筱青等应用MSP法对17例食管鳞状细胞癌、14例贲门癌和18例胃癌以及相应的癌旁正常组织进行检测,胃癌组甲基化阳性率为44.4%(8/18),而胃癌癌旁、食管癌和贲门癌甲基化阳性率分别为5.6%(1/18)、0.0%(0/17)和21.4%(3/14)。Nakase等应用MSP法研究了12例消化性溃疡术后残胃癌和10例胃癌术后残胃癌Runx3启动子甲基化的状态,胃癌组织中Runx3甲基化的比例为63.6%(14/22),相应的癌旁正常组织为27.3%(6/22);Runx3的甲基化状态与Runx3的表达明显相关。甲基化引起的基因表达沉默是由甲基化DNA的组蛋白去乙酰化酶活性恢复引起的,5-氮唑-2’-脱氧胞苷(AZA)是DNA甲基化转移酶抑制剂,曲古抑菌素A(TSA)是组蛋白去乙酰化酶抑制剂。Li等在AZA或TSA或两者共存条件下培养了3株细胞株(NUGC3、MKN28和MKN74),所有细胞株Runx3的表达均被重新激活。Homma等选择Runx3启动子CpG岛呈现完全甲基化的4株细胞株(MKN28,MKN74,KATO-Ⅲ和KWS-1),在加入AZA后上述细胞株Runx3的表达均恢复。证实Runx3启动子区域CpG岛甲基化是导致Runx3表达下调的重要原因之一。Runx3基因甲基化与其表达并不完全平行,可能是由于不同实验研究的甲基化位点不同。田筱青等以RT-PCR法检测8例Runx3基因甲基化的胃癌标本,结果仅3例呈现mRNA表达下调;Waki等以RT-PCR法检测了5株胃癌细胞株Runx3mRNA的表达,其中1株Runx3基因甲基化的胃癌细胞株(KATO-Ⅲ)也表达Runx3mRNA,表明甲基化的Runx3其mRNA水平不一定下调,因此某些位点的甲基化对于Runx3基因沉默更为关键。Homma等应用MSP法研究了10株胃癌细胞株和45例胃癌标本和相应癌旁正常组织Runx3启动子CpG岛连续10个位点的甲基化状态,结果显示启动子CpG岛5’端甲基化阳性率,细胞株为90.0%,胃癌标本和相应癌旁正常组织均为95.6%,而在转录起始点部位细胞株为40.0%,胃癌标本为53.3%,相应癌旁正常组织为11.1%,认为甲基化最初可能发生在Runx3基因启动子CpG岛的5’端,并逐渐向转录起始点方向演进,最终引起Runx3mRNA表达下调,因此转录起始点附近位点的甲基化对于Runx3沉默的意义更大。

4  Runx3蛋白与胃癌

曾超等应用蛋白质印记杂交法检测25例胃癌标本Runx3蛋白的表达,结果发现胃癌组织中Runx3蛋白的表达明显低于相应正常胃黏膜组织,尤其是低分化胃癌更为明显,而高分化胃癌差异并不明显,直线相关分析显示胃癌组织中Runx3蛋白和mRNA的表达具有相关性(r=0.820,P<0.05)。Wei等应用免疫组化方法研究了86例胃癌组织Runx3蛋白的表达,结果显示,与正常胃黏膜上皮组织相比,胃癌组织标本中的Runx3蛋白表达明显降低,并且与生存期降低显著相关(P=0.0005),Cox比例风险回归模型显示Runx3蛋白的表达可独立预测良好的生存率(P=0.036),因而认为Runx3蛋白是胃癌的独立预后因素。

上述研究表明,Runx3基因沉默引起Runx3蛋白表达减少或不表达是胃癌发生的重要机制之一。此外,细胞内Runx3蛋白转运异常也可能参与了肿瘤的发生。Osaki等以荧光免疫细胞化学方法检测细胞内Runx3蛋白的分布情况,结果显示,在表达外源性Runx3的HeLa细胞(转染表达Runx3的质粒)中,Runx3蛋白位于细胞核,而在表达内源性Runx3的MKN-7胃癌细胞株中Runx3蛋白位于细胞质,因此推测,在无刺激情况下,Runx3蛋白位于细胞质中,而遇到TGF等刺激时转入到细胞核中发挥功能,该研究提示Runx3转入过程障碍亦可参与胃癌的发生。Ito等应用抗Runx3单克隆抗体免疫组化方法检查了97例胃癌标本Runx3蛋白的表达,结果发现56%表达Runx3蛋白,其中68%定位于细胞质,而只有32%定位于细胞核,随后又以免疫细胞化学方法检测了6株表达Runx3蛋白的细胞株,其中5株Runx3蛋白位于c细胞质,位于细胞核中的1株(RF48)后被证实为B细胞起源的淋巴瘤而非胃癌细胞,然后选择其中1株(SNU16,对:7743-7750.TGF-β敏感)加入TGF-β,Runx3蛋白在细胞核内积聚,且细胞生长受到抑制,提示Runx3蛋白转入过程障碍而定位于细胞质中将失去其抗肿瘤特性,可能为胃癌发生的另一种机制。总之,Runx3作为新近发现的一种抑癌基因,参与了RUNX3基因364位点C→TTGF-β通路对细胞生长的抑制作用,Runx3基因沉默,尤其突变与胃癌关系的研究。

5  RUNX3与胃癌发生和预后的关系

RUNX家族的3个成员中,RUNX3与胃黏膜上皮肿瘤的形成具相关性。有研究发现RUNX3-/-与P53-/-小鼠杂交后,胃黏膜上皮细胞出现过度增殖和肿瘤形成。但也有报道RUNX3-/-小鼠因中枢脊神经根生长缺陷而致四肢共济失调]。虽RUNX3的表达缺失或高表达对肿瘤形成的作用和机制有待进一步探索,但RUNX3已被大多数学者视为一种抑癌基因,且可能成为影响胃癌预后的独立指标。RUNX3蛋白在正常胃黏膜上皮细胞的细胞质和细胞核中均有表达,但在胃癌标本中其表达明显下降,且其表达程度与患者预后和生存期呈正相关。用免疫组化法对86例原发性胃癌患者的病理标本进行检测,发现RUNX3基因表达缺失、低表达和高表达者分别为26(30.2%)、46(53.5%)和14(16.3%);且其中位生存期各为454d、1124d和3698d[14]。用Cox比例风险回归模型对影响上述患者生存期的协变量,如RUNX3表达水平、年龄、性别、肿瘤分期、手术范围等进行分析,发现RUNX3表达下降是降低患者生存期的独立预后指标。Araki等在对98例肺癌患者5年生存率的调查中也获相似结果,即50例RUNX3高表达者的生存率为79.9%,而48例低表达者仅为57.4%。有研究将腺病毒的RUNX3基因转染到RUNX3-/-的人胃癌细胞株N87和AGS中,发现RUNX3表达增强后能抑制肿瘤生长。在动物模型中恢复诊断学理论与实践RUNX3的表达能抑制肿瘤的发展和转移。虽多数研究结果显示RUNX3缺失或表达下降对胃癌的发生和进展有重要影响,但也有报道在6株胃癌细胞中,有50%RUNX3表达正常。

其他

6.1 CpG岛甲基化和RUNX3的失活与基因丢失的关系

在40%Ⅰ期和90%的Ⅳ期胃癌患者中,RUNX3可因杂合性丢失或启动子区DNA甲基化而失活。Li等用荧光原位杂交法对15例胃癌细胞系和46例胃癌标本RUNX3的DNA倍体进行分析,发现RUNX3多数为异倍体,且其中20.0%(3/15)胃癌细胞系和30.4%(14/46)组织标本发生RUNX3杂合性丢失,且该丢失率随肿瘤的进展而增高(P<0.01)。启动子区CpG岛的甲基化与编码区基因的突变在致抑癌基因失活方面具同等作用。用N-甲基-M-亚硝基脲诱导的鼠胃癌模型中RUNX3启动子因甲基化而呈表达静止。RUNX3有2个操纵转录的启动子,P1启动子周围因含CpG岛少,不易成为甲基化的靶点,而P2启动子位于保守的CpG岛区,易因甲基化致RUNX3不表达,甚或因过度甲基化使甲基化DNA的组蛋白去乙酰转移酶的活性恢复而致RUNX3基因沉默。Li等报道,RUNX3的mRNA表达受抑系RUNX3基因外显子第1部位的CpG岛过度甲基化所致。与非肿瘤性胃上皮细胞相比,胃癌标本中RUNX3甲基化的频率明显增加。研究发现,存在于RUNX1中的P2-P1启动子转换启动的现象在RUNX3中也显现,即当P2启动子因过度甲基化而表达沉默时,P1启动子操纵启动的能力上调;但P1启动子的转录产物是一种缺乏羧基末端的RUNX3蛋白异构体,RUNX3蛋白的羧基端富含脯氨酸和丝氨酸,在转录调控方面起重要作用,而RUNX3异构体所缺失的基团恰为RUNX3转录活性区域的结构域,故其生物学功能与RUNX3蛋白不同。因此,RUNX3的杂合性丢失与CpG岛过度甲基化可能是导致胃癌细胞株或组织中RUNX3功能失活的潜在机制。

6.2 RUNX3与细胞凋亡的关系

细胞不能适时凋亡是肿瘤细胞的特性之一。RUNX3-/-小鼠的胃黏膜上皮细胞凋亡比例减少,并对转录因子TGF-β的反应性下降。TGF-β是多种细胞的生长抑制因子,该信号传导通路的紊乱可以导致各种不同肿瘤的发生和发展。活性TGF-β通过激活或表达细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinases,CDKs)及一些潜在靶点而抑制P15、P21和P27的表达[7],以诱导细胞增殖阻滞于G0~G1期,在胃肠道等不少恶性肿瘤中该信号传导途径可出现异常。此外,在TGF-β杂合性丢失鼠的肝细胞增殖增强,肝和肺细胞的凋亡减少,且大部分发生癌变。Wei等报道外源性RUNX3转染入人胃癌细胞株AGS(RUNX3-/-)和N87(RUNX3-/-)后,前者细胞发生凋亡,后者细胞处于静止期,且RUNX3对两种细胞株的诱导作用呈明显剂量依赖性。用蛋白印迹法分析发现,转染RUNX3+/+的AGS(RUNX3-/-)和N87(RUNX3-/-)能显著下调细胞周期数D1的表达(cyclinD1),上调P27蛋白和半胱氨酸天冬氨酸酶3、7、8(caspase3、7、8)的表达,故提示RUNX3存有类似TGF-β超家族细胞因子诱导凋亡的潜在机制。此外,还发现RUNX蛋白与Smads和p300存有物理结构间的联系。Smad是与TGF-β信号途径相关的蛋白,可被TGF-β激活,并与RUNX3相互作用共同激活或抑制RUNX3特异性靶基因的转录。故RUNX蛋白是TGF-β信号途径中一个非常重要的角色,其与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应,若RUNX3的功能改变,则可以影响TGF-β信号的活性,从而导致胃癌的发生和发展。

总 结

综上所述,RUNX3作为一个新发现的抑癌基因,在调控细胞生长、发育、凋亡和对细胞的信号转导及其他生物学效应方面有着重要而复杂的转录调节作用。RUNX3的丢失或失活可致胃黏膜上皮细胞增生和分化的平衡失调,表现为胃黏膜上皮细胞的过度增生或分化异常,进而参与胃癌的发生和发展。此外,RUNX的其他家族成员RUNX1、RUNX2和编码RUNX1、RUNX2和RUNX3基因的协同因子,即核心结合因子β(corebindingfactorβ,CBFβ)无论在胃癌细胞株,还是在组织标本中都明显下降,且RUNX1、RUNX3和CBFβ表达下降的程度与肿瘤进展相关。故深入研究和探讨基因RUNX家族,尤其RUNX3基因的结构、功能、表达的调节机制和调控网络在胃癌的发生过程中的作用,将为胃癌的诊断和治疗提供新的生物学标记和肿瘤基因治疗的靶点。

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