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人造血管内皮化的研究现状
2009-06-16 09:49   发布范围:公开

 

摘要】 血管内皮细胞不仅是介于血管壁和血液之间的屏障结构,而且还可以有效防止血栓形成,维持血管收缩与舒张、凝血与抗凝血等平衡,在血管腔的表面形成一个抗凝血和抗血栓系统,从而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。人工血管应用于临床后其远期通畅率不高,尤其是在中小口径动脉和静脉移植中。国内外的研究人员通过实验发现促进人工血管内皮化可以减少血栓形成、抑制内膜过度增生,从而明显改善人工血管的远期通畅率。目前人工血管内皮化的方法有人工血管自发性内皮化、自体静脉内皮细胞单期种植法、高密度微血管内皮细胞单期种植法、内皮细胞二期离体衬里等。每一种方法都有其优点和不足之处。人工血管的内皮化可以显著提高人工血管的远期通畅率,但目前各种内皮化方法都有局限性,相信随着分子生物学和基因工程的发展,人工血管内皮化的前景将十分广阔。

关键词】人工血管;内皮细胞;内皮化:综述文献


0 引言

1952年Voorhees在犬实验中,应用涤纶人造血管移植于犬的腹主动脉获得成功,次年即应用于临床,并创立了人造血管网孔理论,这是血管替代物发展史上一个重要的里程碑。随着涤纶(Dacron)、聚四氟乙烯(polytetra—omethylene,PTFE)等材料方面的进展,人工血管在临床上被广泛应用,大大降低了血管疾病患者的病死率和截肢率。然而,血栓形成,感染和新内膜过度增生是造成人工血管(尤其是直径小于6mm)重建术失败的主要原因,这与人工血管内表面不能自发形成完整的内皮细胞覆盖层有关,完整的血管内皮形成是抗血栓和抗感染的最有效的屏障。因此,许多学者将研究焦点集中在人工血管早期内皮化上,现将有关人工血管内皮化的研究综述如下。

内皮细胞的生物学特性

内皮细胞不仅是介于血管壁和血液之间的屏障结构.而且是体内一种代谢十分活跃的内分泌器官,能合成和分泌多种生物活性物质,如分泌一氧化I”、前列环素等活性物质,可有效防止血栓形成,维持血管收缩与舒张、凝血与抗凝血等平衡,在血管腔的表面形成一个抗凝血和抗血栓系统,另外内皮细胞同血细胞一样表面带负电荷,因而具有抗血小板聚集、防止血液凝固和血栓形成的作用,从而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。人工血管与自体血管的主要区别是无内皮细胞衬里,所以如何使人工血管内皮化,显然尤为重要。

1.1  物理改性

所谓物理改性就是通过物理学方法或利用物理原理改变人工血管腔面的某些性状,从而提高细胞的黏附率。用氧气、氨气或两种气体的混合物对人造血管进行等离子体处理,可促进血管内皮细胞的黏附和生长,并且不会对内皮细胞造成毒性反应[1]。Pislaru等[2] 人利用磁力作用将一韧性薄磁片置于针织涤纶血管的外表面,使猪的内皮细胞黏附,以超顺磁性的氧化铁中心球作为细胞标记,在植入时标记细胞注入移植物内l0分钟,一天后移植物腔表面观察到均匀一致的细胞覆盖。这种生物物理的相互作用使得在血流状态下还有充足的内皮细胞保留在腔表面。Bacakoval等[3]将牛肺动脉内皮细胞种植在氟离子照射后的多聚苯乙烯血管腔面(氟离子剂量为5×1014 cm2,150 keV),7d后,人工血管都能明显提高内皮细胞黏附率(提高180%),氟离子照射的作用可能与作为细胞骨架蛋白的波形蛋白和纤维结合素受体高表达有关。内皮细胞带负电荷,而人工血管材料(如PTFE)也带负电荷,相互之间有排斥作用。Bowlin等[4] 利用静电作用使植入的内皮细胞带上短时间的正电荷或少带负电,提高了内皮细胞在血管壁上的黏附能力。

1.2  化学改性

所谓化学改性就是通过化学结合、预衬、预凝等方法改善人工血管腔面结构和性状,促进内皮细胞黏附。合成材料缺乏细胞黏附及生长等生理活动所必需的活性物质,不能保证细胞的有效黏附,如聚四氟乙烯血管仅有10% ±7%的内皮细胞黏附率,暴露于血流后的头30~45min,内皮细胞丢失最多,达70%[5]。细胞外基质(extra—cellular matrix,ECM)不仅为细胞提供黏附结构,而且对细胞的黏附、迁移、增殖、分化以及基因表达都具有调控作用。因此化学改性的目的是:在人工血管内表面预衬特异性黏附物,为细胞提供类似体内组织生长发育的ECM支架条件,有利于细胞生长、分化及功能的发挥,并可调节细胞表型。黏附蛋白通过共价键结合于人工血管,其结构中的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽为主要的细胞黏附决定簇[6-7]。RGD在其前后的其它氨基酸序列的辅助下,与内皮细胞膜的跨膜蛋白家族-整合素家族(Integrins  family,IF)特异结合,从而使内皮细胞黏附。Li等[8]人用黏合剂P15肽(含RGD序列)处理PTFE血管的体内和体外实验,发现P15肽有效地促进了内皮细胞黏附和增殖,与未处理组相比细胞增殖了700% 。纤维蛋白胶、成纤维细胞生长因子-1和肝素涂层可减少血小板沉积率约45.2%。Crombez等[10]固定血管内皮生长因子于PTFE人工血管腔表面,PTFE经血氨处理后带有氨基,使之与人血清白蛋白共价结合在聚合物表面,并使这种蛋白带上负电荷,经过强烈的静电作用使血管内皮黏附因子与人血清白蛋白结合,从而产生有利于与内皮细胞相互作用的聚合结构。Swanson等[11] 则认为血管内皮生长因子是内皮细胞特异性促有丝分裂剂,内皮细胞生长因子涂层支架能减少血栓形成,但不能加速再次内皮化和抑制新内膜增生。Randone等[12] 通过实验认为VEGF预处理的PTFE人工血管具有双重作用:有利于内皮化,却出现了不尽人意的平滑肌细胞密度增加和心肌内膜增生。

2 人工血管植入后自发性内皮化中内皮细胞的来源

2.1  直接来源于吻合口两侧宿主血管的内皮细胞向人工血管的迁移  

    人工血管移植后1周左右,邻近吻合口的人工血管内壁即有较完整的纤维组织愈合,并有内皮细胞覆盖。但仅能在吻合口处延伸数厘米,且易形成增生的内膜,不能达到人工血管完全内皮化的要求。

2.2  微毛细血管通过人工血管网孔向腔内生长   人工血管移植后4周, 由富含毛细血管的结缔组织包绕形成外膜,通过人工血管网孔向腔内生长,逐渐形成人工血管内膜。由于通过网孔向腔内生长的时间差异和易混有较多的纤维组织,特别是在植入血流缓慢的小口径动

脉和静脉时,容易导致血栓形成。

2.3  循环血液中的细胞随血流沉降到人工血管表面    1963年研究人员发现猪的血液循环中存在内皮细胞并可在人工血管腔表面生长。随后,许多学者也观察到这一现象,并提出循环中除了有少量的成熟内皮细胞外可能还有干细胞存在而使损伤的内皮细胞愈合或使人工血管内皮化。Shi等[13]从外周血中分离出纯度达95%的人CD34细胞,用含有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1的培养基培养,15-20 d后可观察到快速增殖的具有内皮细胞特征的贴壁细胞。另外,在体内实验模型中,对狗进行骨髓移植,在其胸动脉降支接入一段涤纶移植物,其两端是长聚四氟乙烯管,可以防止宿主内皮细胞迁移到中部的涤纶移植物上,外周包有一层硅橡胶,可以防止周围组织毛细血管穿透并生长到涤纶内表面,植入一段时间后取出移植物,发现腔面形成了一层供体来源的内皮细胞。Bhaltacharya等[14]在涤纶移植物与硅橡胶之间的缝隙中接种狗骨髓来源的CD34细胞。植入狗胸动脉降支,结果发现涤纶移植物表面形成了一层由内皮细胞组成的内膜。实验排除了成熟内皮细胞污染的可能,进一步证明了来源于骨髓的CD34阳性表达的内皮祖细胞进入到循环血中,在血管移植物上分化为内皮细胞。Ch0等[15]通过粒细胞集落刺激因子动员骨髓释放内皮祖细胞来促进人工血管内皮化也间接证明了循环血中确实存在内皮样细胞的存在。但血液循环中的内皮细胞和内皮祖细胞二者之间的关系仍存在争论[16]

由于自然来源的内皮细胞数量有限、毛细血管生长时间差异及易混有其他细胞,所以易引起血栓形成及内膜增生和再狭窄,导致植入的人工血管远期通畅率不是很理想。

3 内皮种植的方法

3.1 静脉内皮细胞的单期种植  1978年Herring等首次报道此方法,证实了内皮细胞能在人工血管腔内形成完整的内膜,1994年Herring等[17] 将此方法应用于临床,通过观察并没有得到令人满意的效果,种植静脉内皮细胞组的通畅率明显低于自身浅静脉移植物组。同年Jensen等[18]也通过短期和长期的临床对比观察,发现种植内皮细胞的人工血管与未种内皮细胞的人工血管之间无明显差异,同时两者的通畅率均十分低下。国内自80年代开始也进行内皮化人工血管组织工程的研制,汪忠镐等[20]从犬的颈外静脉获取内皮细胞直接或经短期培养后种植到涤纶人工血管内壁上.再植入犬下腔静脉,扫描电镜检查可见内皮细胞层覆盖面大于50% 。

3.2 高密度微血管内皮细胞单期种植 为了得到足够的细胞数 ,1986年Jarrell等从人的肾周脂肪和大网膜脂肪取得大量的微血管内皮细胞。这种细胞植入人工血管行动物的腹主动脉、下腔静脉置换,实验结果满意。汪忠镐等[19]则率先采用犬自体大网膜组织以酶化和密度梯度法获取微血管内皮细胞,用高密度内皮细胞铺植(>5x10个内皮细胞/cm2,约为自然血管内皮细胞数/cm2的5倍)的人工血管植入犬下腔静脉,通畅率提高至80%。继之,他们在移植血管的同时加做为时1周的临时性股动静脉瘘,使得术后百El通畅率达到100%,并得到菲薄、光滑的内膜层,阻断了新内膜增生。在此基础上他们将该技术用于临床,治疗11例布加综合征患者,术后随访9~12年,通畅率为90%,与对照的60%有显著差别。在实验中发现,来自大网膜来源的种子细胞中除内皮细胞外,不可避免夹杂少量间皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等。2001年Salacinski等[21]用新的血管移植物来减少网膜来源的微血管内皮细胞种植的密度和孵育时间。该法在体外和动物实验中尚能取得满意的效果,但迄今为止,微血管内皮细胞单期种植法临床实验结果却令人沮丧,临床应用失败的原因,可能与下列因素有关:①对微血管内皮细胞的生物学特性尚有很大的争议。②动物实验发现,种植入人工血管的大网膜来源的细胞中除内皮细胞外,还夹杂着很多间皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等。这些非内皮细胞的混入种植,是导致人工血管内假内膜增生的主要原因之一。③人工血管假内膜增生可使管腔狭窄,最终引起血栓形成。近来有学者研究通过提高微血管内皮细胞的提取浓度和纯度来减少血栓形成和抑制假内膜过度增生,这将是今后值得关注的研究方向。

3.3  培养的内皮细胞二期离体衬里  Zilla等将内皮细胞种植于纤维蛋白胶预衬的人工血管内壁后,在体外继续孵育8-9d,使人工血管内壁形成完整的、具有良好抗切应力和抗血栓形成的内皮细胞单层,此即为人工血管内皮细胞离体衬里技术。这就是“两步法”:种植内皮细胞的人工血管经体外培养,待其腔面形成完整的内皮细胞层后再植入体内。Zilla等在动物实验的基础上,将离体衬里技术直接应用于临床获得成功。报道了用内皮化人工血管置换患者髂-股动脉33例,经血管造影及铟标血小板等方法,追踪观察3年,实验组通畅率明显高于对照组(P<0.05)。2005年Bordenave等[22]在临床随访20年证明该技术处理过的聚四氟乙烯人工血管仍有很高的通畅率。

由于内皮细胞体外培养生长缓慢,且传代5—8代后迅速发生衰老,直接影响细胞种植后的功能体现,同时由于人工血管内皮层培养时间较短(1d~1周),可能难以建立正确的细胞连接和信号传递途径。无法充分体现内皮细胞的调节功能,并且种植的内皮细胞抗血流切应力很差。要真正构建理想的有功能的组织工程血管还有待于多方面的深入研究,目前的研究提示适当的粘附底物处理生物材料表面有助于细胞的粘附和保留。材料表面性状在很大程度上决定着细胞黏附的稳定性。运用新技术制备新材料或对材料表面进行改进将有助于血管移植物内皮化。Hsu等[23]在细胞培养种植的技术上寻求突破,用可旋转的反应器来培养和种植内皮细胞,能够提高内皮细胞的黏附力。近年来,随着基因工程技术在组织工程的应用,有望通过基因重组技术对种植的内皮细胞进行基因修饰,通过改变抗凝和促凝基因的表达水平,增强内皮细胞抗凝物质的的合成,减少促凝物质的产生,从而提高种植内皮细胞的抗血栓功能。

4 内皮细胞的基因修饰

单纯EC种植因腔内血栓形成导致临床效果并不理想。要使EC获得稳定的抗凝血或者纤溶活性,最可靠的方法是用基因工程的方法来改变其遗传物质的特性,从而使其表现出稳定的抗血栓活性。如抑制促凝血和抗纤溶因子的表达,或者增加抗凝血和促纤溶因子的表达,都将有利于EC表达出更高的抗血栓活性。组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator tPA)是溶解早期血栓的关键酶。Kimura等[24]实验证明tPA基因转染EC后,一般均能表达tPA,且tPA的活性较高。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase—typep—lasminogen activator,uPA)是体内纤溶酶原激活物的另外一种成分,其作用和tPA类似,也具有很强的促纤溶作用。Lee等和Falk等[25]成功地将uPA基因转染到EC,转染后的EC膜上可以表达uPA,在特定刺激下,uPA可以表现出强大的纤溶活性。凝血调节蛋白(thrombo—modulin,TM)是EC表面的一种糖蛋白,与凝血酶结合后能激活蛋白C,使其活性增强1~2万倍,蛋白C被激活后具有阻断血液凝固系统的作用,与凝血酶-TM复合物协同作用,可使凝血系统中凝血因子和血小板凝血活性丧失。wlau等在兔动脉内膜损伤模型中将TM基因转染到EC中,发现EC抗血栓性能增加,治疗组的血栓面积占总血管腔面积的28.61%±3.31%,而空白病毒组和非病毒组分别占86.85%±2.82%和70.52%±3.72%。水蛭素(hirudin,HD)是凝血酶的抑制剂,Lundell和Rade实验证明具有强大的抗血栓活性和抑制新内膜增生。可能的机制是减少血小板的沉积和直接或间接抑制平滑肌细胞增生和迁移。目前,因子x的特异性抑制剂,组织因子旁路抑制物(TEPI)!环氧合酶21及前列腺环素合成酶等抗凝基因,均表现出一定的抗血栓、抗增殖作用。

5 干细胞人工血管内皮化的研究

干细胞在血管组织工程中的应用是目前研究的热点之一,研究主要包括来自造血系统的干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等。美国西雅图的Hope心脏研究所和俄克拉哈马大学医学院发现在涤纶人工血管置换犬降主动脉的动物模型中,粒细胞集落刺激因子能促进人工血管内壁的内皮细胞生长,他们认为此内皮细胞很可能由循环中的骨髓细胞衍生分化而来。为证明此判断,他们将1条供体犬的骨髓移植给受体犬,8周后对受体犬的降主动脉植入涤纶血管,术后12周回收标本并对其内皮细胞进行DNA鉴定,结果发现此内皮细胞来源于供体,同时进一步证实了骨髓中的CD34细胞可分化为内皮细胞。在血管组织工程应用方面。研究人员用自体内皮细胞祖细胞作为种子种植于人工血管的表面使其内皮化,可以防止涤纶膜易形成血栓、易被细菌污染、易形成假性内膜等问题,同时避免异源内皮细胞种植带来的免疫排斥反应。HE等通过实验方法得出种植有内皮细胞祖细胞的人工血管内表面具有更好的增殖和抗血栓形成的能力。随后他们又将犬自体外周血中分离得到的内皮细胞祖细胞种植于小口径人工血管内表面,并置入6只犬的颈动脉段进行体内实验,3个月后发现12根人工血管中的11根是通畅的,并且管腔内有大约300μm的新生血管壁形成,没有血栓形成。郑奇军等129]也在开展相关的研究,在体外将骨髓来源的CD34细胞成功分化为血管内皮细胞。汪忠镐等在体外和体内的实验中,成功地将内皮细胞祖细胞诱导分化形成内皮细胞,并种植于人工血管内表面,然后植入犬的下腔静脉和腹主动脉,结果内皮化人工血管植入动脉闭塞率0,狭窄率12.5%;人工血管植入静脉闭塞率12.5%,狭窄率25.0%,获得理想的内皮化和通畅率[26,27]

来源于骨髓和一些器官中的间充质干细胞是一种原始的多能干细胞,具有多向分化潜能,而其中骨髓间充质干细胞易于分离培养,增殖能力强,体外培养多次传代后仍保持多向分化潜能,国内的祝建中等尝试在体外用血管内皮生长因子诱导骨髓间充质干细胞分化血管内皮细胞[28]。骨髓中除了间充质干细胞和造血干细胞外,另外还含有骨髓基质细胞,骨髓基质细胞中11含有多种细胞的前体细胞/祖细胞克隆,其中包括内皮细胞,并能向这些细胞的成熟型分化,而有望成为血管组织工程种子细胞的新来源,这有待于进一步研究其诱导分化的机制。

2005年McCloskey等[29]用鼠的胚胎干细胞培养出内皮细胞并应用于血管组织工程,使得组织工程血管的种子细胞来源更充裕。尽管胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜力,但随之而来的伦理问题也值得重视。使得胚胎干细胞的应用受到了限制。

尽管人工血管内皮化和抗血栓的研究

各个环节中都取得了可喜成绩,但仍然存在很多问题:(1)许多研究仍处于实验阶段。(2)内皮化人工血管获取过程复杂,费用昂贵,难以在临床中推广应用。(3)有利于EC黏附生长的人工血管材料仍在探寻中。(4)种植技术和方法有待进一步提高。(5)基因修饰技术在人工血管的应用仍限于抗血栓方面。相信随着细胞分子生物学技术和基因工程技术的日藤成熟,人工血管内皮化的研究将进入一个崭新的阶段。

 

参 考 文 献

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