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NoGo基因及其相关蛋白与中枢神经再生的研究进展
2009-06-16 09:51   发布范围:公开

口腔医学系  8队  王  培

【摘  要】NoGo蛋白(勿动蛋白)与NgR (勿动蛋白受体)和中枢神经再生抑制密切相关。NoGo基因编码的三种蛋白质:NoGo-A、NoGo-B和NoGo-C是中枢神经系统髓鞘中具有抑制神经生长活性的跨膜蛋白。NoGo受体是一种糖基醇磷脂结合蛋白,NoGo-66与p75NTR-NgR形成的受体复合物结合导致生长锥塌陷及神经突起生长的抑制。由于掌握了这种完整蛋白及其基因,预计将准确地确定NoGo抑制轴突生长的部住、分子机制等。这为寻找更好的方法来阻止这种蛋白的作用制造了有利条件。本文概述NoGo及其受体的结构、功能和它们的作用的研究概况,并且展望其可能的临床应用前景。

【关键词】NoGo蛋白;神经再生;CNS;NoGo基因;受体;轴突再生

引言

哺乳动物周围神经系统损伤在神经系统发展过程中的任何阶段都能得到修复。胚胎时期的中枢神经系统(central nervous system)具有良好的再生性,但成熟的CNS却几无再生的能力[1]。成年哺乳动物,尽管中枢神经损伤后也能形成生长锥,但却无法长出新的轴突。成年动物中枢神经损伤后不能修复的原因主要有两类:其一是中枢神经系统的内在特性使其不能再生;其二是中枢神经系统的外部微环境对其再生的影响[2]。目前,大多数人认为外部微环境起主要作用。为此,神经科学家们满腔热情以极大的精力和资金投入到这方面的研究。2000年科学家们成功克隆了抑制受损神经再生的基因NoGo基因,这已成为当前研究中新的热点,并有望成为解开CNS再生之谜的一把金钥匙。在此,我们主要阐述这一很有研究前景的中枢神经系统外部微环境中的抑制分子NoGo及其在中枢神经再生中的作用。


1  NoGo的发现

    早在一个世纪以前,科学工作者就开始试图解开成年动物的中枢神经轴突在受到损伤后不能再生的谜团。二十年前,David等报道成熟的CNS的神经元轴突能够在外周神经移植物中再生,提示CNS自身生长环境中可能含有某些抑制性物质,导致再生能力受限。后来,Schwab发现,由少突胶质细胞产生的、分子量分别为35KD(NI一35)和250KD(NI一250)的两种蛋白具有强烈的抑制中枢神经再生的作用。2000年,三个实验室分别独立报道了一个令世界震惊的未知基因NoGo,并证明它能够编码上述抑制性蛋白因子[3]。Chen等[4]用相关序列探针的方法从大鼠cDNA库中获得了NoGo的cDNA,DNA测序和Northern印迹表明其包含三个不同的转录子。提示,NoGo基因至少编码三种蛋白NoGo-A、NoGo-B和NoGo-C。Schwab等研究了来源于CNS轴突周围起隔离鞘作用的磷脂,并分离出相关糖蛋白(MAG)[5],NI35和NI250,后两者的分子量分别为35kD和250Kd[6、7],证实它们对CNS轴突有很强的抑制作用。Caroni制备的IN-1单克隆抗体能与这些蛋白结合,并中和少突胶质细胞和磷脂蛋白对轴突生长的抑制作用。

2  NoGo的结构

由于使用不同的启动子和mRNA的不同拼接,NoGo基因有3个mRNA转录本,它们所编码的蛋白质分别称为NoGo-A、NoGo-B和NoGo-C。Chen等纯化牛的bNI250,蛋白抑制CNS轴突生长的活性能被单克隆抗体NI-l中和,利用该蛋白的6个肽序列筛选备cDNA文库,通过序列分析发现NoGo-A编码1163个氨基酸,编号AJ2429611;NOGO-B编码360个氨基酸,编号AJ2242962;和NOGO-C编码199氨基酸,编号AJ2242963[8]。等采用一系列引物扩增和克隆NOGOcDNA ORF(读码框架)方法筛选人的cDNA文库[9],发现NoGo基因产物有三个不同的异构体,分别为NoGo-A、B、C。(编号AJ251383,AJ251384,AJ251384)最长的ORF为1192个氨基酸(NoGo-A);NoGo-B由于剪切位点不同产生缺少186~1004个氨基酸的细胞外区域;最短的是NoGo-C,它含一个功能不清的跨膜区,缺少186—1004残基,但有一个短的可变的氨基酸区。

令人费解的是,NoGo蛋白有两个完全独立的具有抑制活性的结构域:amino—NoGo和NoGo-66。NoGo-66是指2个疏水区之间的氨基酸序列;重组amino-NoGo片段包括从NoGo-A氨基端到第1个疏水区的氨基酸序列[10]。目前认为,NoGo的拓扑结构有3种可能:(1)NoGo的氨基端和羧基端位于细胞液中,NoGo-66位于内质网腔或胞外;(2)NoGo-66位于细胞液中,其余部分位于内质网腔或胞外;(3)NoGo-66氨基端位于细胞液中.其余部分位于内质网腔或胞外。3种异构体(NoGo-A、B、C)在氨基端均无通常作为信号肽的疏水区,而在其羧基端有一致的序列作为网状蛋白信号。3个异构体在接近羧基端有2个长的疏水区(35或36个氨基酸),NoGo-A有3个保守的疏水序列,NoGo-B有1个短的保守序列,与牛N1220内膜蛋白有相似的特征。在羧基端,NoGo-A、B、C具有与磷脂蛋白(PMP-22或MAL)相似的2个赖氨酸的内质网膜定位信号[11、12]。NoGo-A可能是膜连蛋白,相对分子质量为126000,有7个潜在的N-糖基化位点和多个糖基化位点,其富含酸性氮基酸和脯氨酸,主要集中于2个区段。富含脯氨酸的区段,其结构功能和蛋白-蛋白的相互作用有关,它包括长的细胞外区,该区1024残基为N-糖基化位点,有2或3个跨膜区。表位图谱研究显示,在羧基端2个跨膜区之间的短的66个氨基酸的环在细胞膜外面或在细胞膜上,而氨基端在细胞内,当NoGo-A的氨基区与异种蛋白结合时,不能被细胞膜摄取和分泌,故此区域短的疏水端可能位于细胞膜上。

3  NoGo受体的结构

Alyson等[13]已分离鉴定了能够与NoGo蛋白66个氨基酸环结合的受体(NgR)。2001年,Strittmatter’发现并克隆了NoGo-A受体(NoGo-66receptor,NgR),氨基酸序列和蛋白结构分析表明NgR是一种糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidy1inosito1,GPI)锚定膜蛋白,由473个氨基酸残基组成,从N端到C端,包含一个信号肽、亮氨酸重复序列型N端(1eucine-rich repeat N-terminal,LRRNT)、8个亮氨酸重复序列(1eucine-rich repeat,LRR)、碳末端LRR(C-terminal LRR,LRRCT)以及一个GPI结构。X线晶体衍射提示NgR分子形似弯曲的香蕉[14],有一个凹面与一个凸面,长宽高大约为0.80nm×0.35nm×0.35nm,含有少量的二级结构。分子凹面为平行的p片层,凸面为一些连接p片层的环状结构。LRR结构域占据了NgR分子的大部分空间,每一个亮氨酸重复序列由一个凹面的8片层与延伸至凸面的环状结构构成。通过系统、有选择地截去部分NgR结构域,并将NgRGPI跨膜结构域与L1细胞黏附分子跨膜结构域互换,发现所有的NgRLRR结构域对于NoGo-66结合都是必须的,C端结构域对于NgR信号转导是必须的,GPI锚着结构对于NgR传导抑制信号并不关键,但GPI锚着结构的存在能够使NgR产生自身聚集J。由于NgR属于GPI锚定膜蛋白,缺乏细胞内信号转导区域,需要一个跨膜的协同受体介导信号传递。在含有髓磷脂的培养基上切去C-末端(CT)的NgR虽过度表达,但却能引起神经元的突起生长,提示NgR的C-末端可能是其与协同受体结合所必须的NgR的GPI后来研究发现,NgR也可与MAG和OMgp结合并介导MAG和OMgp的抑制作用[15]。最新研究发现,NgR是通过与p75和Lingo一1组成受体复合体而发挥作用的[16]。p75是TNF超家族第一个成员,属于跨膜I型蛋白,其空间结构包括细胞外区,跨膜结构和细胞内区、抑制因子与NgR结合后,信号通过p75传递给RhoA,RhoA再作用于下游的效应器ROCK,激活cAMP引起细胞内信号传递。但在重组的非神经元细胞内,NgR与p75的结合并不能激活RhoA,表明在NgR复合物中可能还存在另一种成分,经过检测,它是一种LRR蛋白Lingo-1,并证明NgR、p75和Lingo-1三者组成了NoGo-66受体复合体。

4  NoGo及其受体的生物学功能

4.1 NoGo-A的功能

NoGo-A可能通过以下几种方式抑制神经元轴突再生:完整少突胶质表面的NoGo-66直接与损伤神经元的NgR结合,简称细胞一细胞方式;从受损少突胶质脱落下来的含NoGo-66的膜片段与损伤神经元的NgR结合,称为细胞膜方式;还有一种是完全溶解的少突胶质释放NoGo-A的N端和NoGo-66的可溶性蛋白水解片段,与其受体结合,其抑制作用更强[17]。但是NoGo-A在发育的神经元胞体和轴突表面有表达,而且这些组织的轴突生长没有受到抑制,同时,NoGo-A还在发育的神经元轴突的生长锥中被发现,它是否与轴突的生长有关呢?由此可见,NoGo-A的功能可能不仅是抑制轴突的再生,很有可能它参与了早期髓鞘的形成[18]

4.2 NoGo的功能

NgR的作用主要是保持皮质海马等区域神经元回路的稳定性以及允许这些区域在结构上有一定的可塑性。暂时性的NgR下调将允许活性差的神经纤维在有营养因子的作用下再造,而且NgR和细胞黏附因子下调在多种神经营养因子的共同作用下允许神经末梢生长[19、20]。NoGo-A和NgR之间可通过多个位点交互作用,从而使NgR被NoGo-A激活。含有NgR的神经元在NoGo-A存在时,其生长核心均遭受破坏,而无NgR的神经元则不受影响。这些不受影响的神经元在转染了NgR后又变得对上述物质异常敏感。相反,使用抗NgR作用之后,它对神经元再生的抑制作用则大对MAG和OMgp的类似研究中发现,NgR也能与MAG和OMgp结合并介导其中枢神经轴突生长的抑制作用[21、22、23]。同NgR与NoGo-66的结合一样,NgR与MAG和OMgp的结合必须有LRR结构,并都认为这种结合是GPI的依赖性。Domeniconi等[24]报道了与NoGo-66结合的NgR同MAG具有高度亲合性,二者可能对轴突再生起着协同的抑制作用。他们在培养细胞中发现:当二者浓度相等时,彼此没有影响,但随着NoGo-66的增加,MAG与NgR的结合则会明显降低。但对此也存在不同意见,Betty等[25]认为MAG能和NgR结合并发挥抑制作用,MAG与NoGo-66结合于NgR的LRR序列的位点不同,它们之间不存在竞争。理由是:在培养基中增加NoGo-66的量并不影响MAG与NgR的结合,而且NoGo-66的特异竞争性拮抗剂NEP1-40阻止了NoGo-66与NgR的结合,却不影响MAG发挥作用。2002年,Wang等[15、26]发现NgR不仅是NoGo-66与MAG的受体,也是OMgp的结合蛋白,OMgp与NgR的结合位点与NoGo-66与NgR的结合位点之间存在交叉,OMgp和NoGo一66与NgR的竞争性结合并通过NgR独立起作用。因此,NgR是CNS髓磷脂中3种主要轴突生长抑制因子NoGo-A、MAG、Omgp发挥作用的集中点,成为近期众多研究者关注的目标。

NoGo一66的受体2001年,Fournier等[27]又有震惊世界的报道,找到了NoGo一66的受体。首先,他们应用碱性磷酸酶(AP)融合蛋自法检测到一种AP-NoGo-66融合性蛋白,一种富含亮氨酸的脑特异性蛋白。它与神经元的结合具有高亲和性和可饱和性,解离常数为3nM。此外,它与可溶性NoGo-66亦具有高度亲和性。因此,他们把这种AP-NoGo-66融合性蛋白命名为NgR,并进一步检测NoGo-66与NgR之间是否存在直接的相互作用。他们发现:①在细胞移植物中,用myc标记的NgR能与GST标记的NoGo-66相互结合,表明两者能够形成蛋白复合体;②一般来说,胚胎早期的鸡视网膜神经元对NoGo-66并不敏感,但是,这些神经元经用NgR cDNA编码的病毒载体转染后,却表现出对NoGo-66较高的反应敏感性。他们推断,NgR即是NoGo-66的一种功能性细胞表面受体;两者的特异性结合介导了NoGo-66的中枢神经抑制活性。Foumier等[27]证实,NgR cDNA编码的NgR是一种包含473个氨基酸序列的蛋白质。该蛋白在氮末端上具有一个易位信号序列,继之排列着8个富含亮氨酸重复序列(LRR)的基序和一个LRR碳末端基序(LRRCT)。以上基序同样出现在其他多种细胞表面分子中。另外,NgR的碳末端有一个磷脂酰肌醇脂(GPI)信号序列,通过酶裂解法证实,正是借助于GPI,NgR才得以固定在神经元胞膜表面上。

    NoGo-66与NgR的特异性结合抑制CNS的再生Foumier等[27]通过原位杂交证实NgR mRNA广泛分布于CNS中众多类型的神经元,包括大脑皮质神经元、海马神经元、小脑蒲肯野氏细胞和脑桥神经元等。NgR的分布与其mRNA的发布基本一致。此外,NgR mRNA并未发现存在于中枢白质,而后者的少突胶质细胞却表达NoGo-A。据此他们认为,存在于中枢白质的NoGo-66与分布于中枢神经元(灰质)的NgR正是通过特异性的配体受体式结合,才使原先对NoGo-66并不敏感的中枢神经元具有对NoGo-66较为敏感的反应性,从而表现出NoGo-66对中枢神经的抑制活性。实验显示NgR主要表达于脑,这与NoGo-66选择性作用于神经元细胞而对成纤维细胞没有作用相一致。原位杂交实验进一步表明NgR广泛表达于中枢神经系统的神经元细胞,包括大脑皮层神经元、海马神经元、小脑蒲肯野氏细胞和脑桥神经元。在免疫组化实验中,用NgR抗体可以在胚胎脊髓神经元细胞的轴突上检测到NgR蛋白的存在;在对NoGo敏感的晚期(13天)鸡胚神经背根节(DRG)上也可以检测到N蛋白的存在;而在对NoGo不敏感的早期胚胎DRG或视网膜神经元却没有或很少有NgR蛋白。这些NgR的表达模式与其介导NoGo抑制轴突再生的作用相一致。以上研究结果表明NgR是NoGo-66的功能受体,而NoGo-66是中枢神经系统轴突再生的抑制剂[28]

4.3 NoGo蛋白在CNS再生中的抑制性作用

NoGo蛋白的几种生理特性表明其是一种中枢髓鞘源性神经生长抑制因子[29]。首先,它被证实存在于CNS的白质内,包括中枢髓鞘的内外两层以及培养中的少突胶质细胞;其次,NoGo蛋白可导致生长锥塌陷并抑制神经元突起的延伸,亦可被特异性抗体IN-1所识别,提示其为以前命名的中枢髓鞘源性抑制蛋白NI-250/NI-220;此外,针对NoGo-A的抗体可抵消CNS髓鞘在体外的抑制活性,证实NoGo蛋白具有强烈的中枢神经生长抑制活性。

5 展望

NoGo基因的发现,似乎让人们看到了中枢神经系统损伤后再生的希望,建立基因敲除模型,以及阻断NgR与NoGo-A分子下游信号传导似乎是解决问题的新的突破口,但关于NoGo-A及NgR目前还有很多未知数,而且影响CNS再生的因素众多,国际上至今仍未找到恰当的干预措施,中枢神经损伤仍然是不能恢复的损伤。现代医学要求我们在更深的层次上进行这方面的研究,这是极具挑战性的课题。除了已知的抑制分子,一些以前被认为是发育导向因子的分子也可能在抑制成年中枢神经再生中起重要作用。。从临床角度乐观地说,即使有限的功能恢复也是很有价值的,但这些新分子的研究给我们带来了希望的曙光。我们相信人类最终会达到一个新的时代,那时中枢神经损伤不再是困扰医生和患者的疾患,现在痛苦的患者那时也将可以享受人生的快乐时光。解决中枢神经系统损伤后的再生,依然需要我们进一步深入探索。


参 考 文 献

1.         Perry AB,Flanagan JG.NoGo domains and a № go receptor:implications for axonregeneration [J].Neuron,2001, 30:11~14.

2.         Homer PJ, Cage FH. Regenerating the damaged central nervous system.Nature,2OOO。407 (6807):963-970.

3.         Goldberg JL Barres BA.NoGo in nerve regeneration [J]. Nature,2000,403:369~370.

4.         Chen MS,Huber AB,Haar ME,et al .NoGo-A is a myelin-associated neurite  outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature,2000,403:434-439.

5.         schwab ME.Caroni P. Oligodendrocytes and CNS myelin arenonpe rmissive substrates  for neurite growth and fibroblast spreading invitro.J Neurosci+1988.8:238l-2393

6.         Mckenacher L,David S  Jackson DL,etal.Identification    of myelin-mesociated glycoprtotein an amajor mryelin-derived imhibitor of neurite growth [J]. Nevnon,1994,13(4):805-811

7.         L I M  Shibetn  A,Li C,et al.myelin-maociated glycopatotein inhibits neurite/accon growth nd aueed groeth cone collapae[J].J Neurosci Rea,I996,46(4):404-414.

8.         Bregman B S,Kunkel—Bagden E。Schnell I ·el a1.Recovery fromspinal cord injury mediated by antibodies to neurite growth inhibitor[J].Nature,1 995,378(6556):498—501.

9.         Chen M S.Huber A B.Van der Haar M E·elⅡ .NoGo-A is amyelin associated neurite outgrow th inhibitor and an antigenfor monoclonal antibody IN-I[J].Nature,2000.403(6 768): 434-439.

10.     Prinjha R.Moore S E,Vinson M 。e't a1.Inhibitor of neurite OUtgrowth in humans[J].Nature,2000。403:383-384

11.     Spillmann A A.Bandtlow (、E.I Ottspeich F,el a1.Identificationand characterization of a bovine neurile grwth inhibitor(bNI220)[J].J Biol(7hem,I 998,273(3O):19 283-19 293.

12.     SChneren—Wiemers N,Valenacla D M ,Frank M ,et“ .Charac—terization of a rat gene,rHAI ,encoding a protein with four hy—drophobic domains in central and peripheral myelin[J].J Neurol,1995,15:5 753—5 764

13.     Alyson E,Fournier A E,Grandpre T,el a1.Identification of a receptor mediating NoGo一66 inhibition of axonal regeneration [J].Nature,2001,409(6 818):341-346.

14.     Foumier AE,Gould GC,Liu BP,et a1.Truncated soluble NoGo recepter binds NoGo一66 inhibition of axon growth by myelin[J]. J Eumsci,2002,22(20):8876

15.     Wang KC,Koprivica V,Kim JA,et a1.Oligodendrocyte—myelinglycoprotein is a NoGo receptor ligan d that inhibits neurite outgrowth[J].Nature,2002,417(6892):941-944

16.     F~bin MT.Myelin—associated inhibitors of axonal regeneration in the adult mammalian CNS[J].Nat Rev Neurosci,2003,4(9): 703.

17.     Ng C E,Tang B 1 .NoGos and the NoGo一66 receptor;factors in-hibiting CNS neuron regeneration[J].Neurosci Res,2002,67(5):559-565.

18.     熊南翔.NoGo—A与NgR研究的新进展[J].国外医学神经病学神经外科学分册,2003,30(4):396

19.     刘仁红,周晓光.NoGo蛋白及其受体在中枢神经再生中的作用[J].国际儿科学杂志.2006,33(2):111

20.     Prinjha R,Moore SE,Vinson M,et a1.Inhibitor of neurite out—growth in humans[J].Nature,2000,403(6768):383

21.     WangKC,Kim JA,SivasankaranR,eta1.Fr75 interactswiththe NoGo receptor 118 a co—receptor for NoGo,MAG and OMgp.Nature, 2002,420:74 —78

22.     Wong ST,Heuley JR,Kanning KC,et a1.A 075(NTR)andNoGo receptor complex mediates repulsive signaling by myelin—associated glyeoprotein. Nat Neurosci,2002,5:1302—1308

23.     Domeniconi M,Cao Z,Spencer T,et a1.Myelin—associated glyeoprotein interacts with the NoGo66 receptor to inhibit neuriteoutgrowth. Neuron,2002,35:283—290

24.     Foumier AE,GnmdPre T,Strittmatter SM.Identification ofare. eeptor med iating NoGo一66 inhibition of axonal regeneration.Nature,2001,409:341—346

25.     Liu BP,Fournier A,GrandPre T,et a1.Myelin—associated SlY coprotein as a functional ligand for the NoGo-66 receptor. Science.2002.297:1l90— 1l93

26.     BartonWA,Liu BP,TzvetkovaD,Structureand axon outgrowth inhibitor binding of the NoGo一66 receptor an d related proteins. EMBO J,2003,22:3291—3302

27.     Foumier AE, Grandpr6  T,Strittmatter  SM.Identification of a receptor mediating NoGo-66 inhibition of axonal regeneration[J].Nature,2001,409:341—346.

28.     Brittis PA,Flanagan JG.NoGo domains and a NoGo receptor:implica—tionsfor axon regeneration.Neuron,2001.30 (1):ll—l4.

29.     Perry AB,Flanagan JG.NoGo domains and a № gorece—ptor:imphcations for axonregeneration[J].Neuron,2001, 30:11~14.

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