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日本血吸虫特异性抗体与诊断抗原的应用研究进展
2009-06-16 09:55   发布范围:公开

航空航天医学系 王 祥

摘  要血清学抗体检测因检测成本低, 操作易掌握, 方法较成熟, 被广泛应用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情监测。为提高检测的敏感性和特异性、区分病程、考核疗效, 已有大量研究用以探索短程抗体及诊断抗原。本文将日本血吸虫特异性抗体、诊断抗原的应用研究进展综述如下。


关键词特异性抗体;诊断抗原;血清学诊断


1 循环抗体

人体感染日本血吸虫后发生体液免疫,可产生特异性抗体。了解感染后人体内特异性抗体IgM 、IgG、IgA、IgE及其变化, 对血吸虫病早期诊断、病程区分、疗效考核均具重要意义。

1.1 IgM IgM是人体感染血吸虫在潜伏期和急性期产生的优势抗体, 有助于早期诊断[1]。IgM属阻断型抗体,在一定程度上增加了宿主对血吸虫的易感性[2]。急性血吸虫病患者血清中,可溶性虫卵抗原IgM(IgM-SEA)的检出率高达100%[3]

1.2 IgA Hernandez等[4]研究发现,蠕虫成虫抗原IgA (IgA-AWA)的滴度在年长者体内较高, 为保护性抗体,并推断血吸虫童虫移行至肺时即产生IgA起到保护作用。尽管初次感染和重复感染者体内IgA相差不,大但经化疗2个月后, IgA-AWA和IgM-AWA在初次感染者体内消失快,IgA-AWA在重复感染患者体内升高[5]IgA-SEA也是急性感染者体内的优势抗体[6],Valli等[7]也证实血吸虫特异性IgA、IgM 抗体具有早期诊断价值。

1.3 IgE IgE是保护性抗体[5],感染曼氏血吸虫小鼠,直至虫体发育成熟并产卵,方可在血清中检测到IgE,但IgE本身在初次感染中并不单独发挥作用[8];只有与单核巨噬细胞、嗜酸粒细胞及血小板协同作用才可杀灭血吸虫童虫, IgE水平越高,抗血吸虫的感染能力越强[3]。在重复感染患者体内,IgE-AWA与年龄、化疗次数、IgG4-AWA呈正相关;化疗后IgE-AWA升高,但IgE-SEA保持稳定水平[5]

1.4 IgG  近期感染者,90%可检测到IgG,但亲和性较低。低亲和性的IgG以及IgM/IgG之比值若大于1,可能为近期感染;而IgG-AWA总体水平可评价重症感染的程度[9]。IgG1-SEA在急性期滴度较低,6个月后滴度显著升高,可作为评价急、慢性血吸虫病病程的指标[4]; IgG1也可作为诊断脑型血吸虫病的重要免疫学指标[10]。IgG2-SEA和IgG3-SEA是血吸虫病的急性期优势抗体[4],而且IgG2-SEA水平与虫卵量呈负相关,在女性患者体内较高[11]。IgG4 属阻断型抗体,其阻断作用的发挥可能是通过影响IgE的抗原识别以调节免疫反应而实现的[3]。IgG4-AWA与IgE-AWA共同发挥免疫调节作用并达到平衡,两者呈正相关(r=0.05)[5,12]。IgG4-AWA、IgG4-SEA水平与虫卵量呈正相关, 在男性患者体内较高[10];IgG4-AWA在20~29岁患者体内达到高峰,该年龄层患者易再感染[12]。在血吸虫病患者中,肝纤维化者体内IgG4-SEA水平明显高于未发生肝纤维化者。可见,高水平的IgG4-SEA产生可提示血吸虫病肝纤维化的发生[13]。Li等[14]研究了日本血吸虫病易感人群体内抗体型别,发现再感染者体内的IgG1-AWA和IgG4-AWA滴度较高, IgG4/IgE比值越高越易再感染。较高水平的IgG4-AWA可作为初次感染者化疗依据, 但在重复感染患者体内,化疗12个月后仍保持较高水平,不宜作为化疗依据。SEA引起人体IgG 亚类反应的表位不同:IgG2反应限于对过碘酸钠敏感的糖表位,反应抗原多为高分子量,且通常不被其他型别IgG所识别。IgG4仅与多肽表位反应,而IgG1与IgG3可同时针对多糖及多肽表位[15]

2 诊断抗原

长期以来,血清学诊断抗原主要是血吸虫成虫和虫卵的整体固相或可溶性成分,粗抗原因含有其他寄生虫或宿主的共同成分,影响免疫诊断的特异性。随着分子生物学、生物化学和免疫学等技术的发展,目前,纯化抗原、重组抗原较易获得,促进了血吸虫病。

2.1 纯化抗原 从日本血吸虫各发育阶段虫体中分离纯化出具较好诊断价值或疗效考核意义的抗原有:尾蚴的Mr23000和Mr66000蛋白、尾蚴弹性蛋白酶、SEA的纯化片段CEF6 (cation exchange fraction6, CEF6)、SjAW A31000/32000和SjAWA34000[16-19]等。Doenhoff等[17]分别用SEA及CEF6包被ELISA 检测患者血清,发现抗体的反应性与虫卵量相关。化疗6个月后, CEF6-ELISA、SEA-ELISA 检测的平均A值分别下降60%、45%,两者差异有统计学意义(P<0.01),从而认为CEF6可用于考核疗效。以纯化的SjAW A31000/32000分子包被石英晶振建立的压电免疫传感器,对阳性血清样本不仅能定性,而且能定量[18]。周晓红等[19]研究发现,SjAWA34000不但具良好的早期诊断价值而且具较好的重复性与特异性, 可与上述SjAWA31000/32 000优势诊断蛋白相媲美。此外,SjAWA21000、54000、15000与SEA140000、50000、45000、38000均具有早期诊断的潜在价值。用SjSEA38000纯化抗原建立的胶体金标记dipstick 快速诊断,具较好的敏感性和特异性[20]

2.2 重组抗原 重组抗原比纯化天然抗原分子更易获得,既可保持天然抗原的敏感性,又可达到较高的特异性,批量生产可解决诊断抗原的材料来源。

2.2.1 成虫重组抗原 Sj22.6是一种重要的表膜相关抗原,纯化后可识别日本血吸虫病患者血清,并与正常人血清无交叉反应[21]。王新军等[22]从Sj22.6抗原中初步鉴定出P4、P5 和P6 共3个T细胞表位。余传信等[23]重组表达日本血吸虫中国大陆株Mr23000分子的大亲水片段的融合蛋白,可用于血吸虫病诊断和疗效考核。重组蛋白PR26 (Mr26000 recombinant protein, PR26)检测急性血吸虫病患者的抗IgGPR26,其阳性率为89%,慢性患者的抗IgG-PR26阳性率为26%,而正常对照的阳性率为0%。血吸虫病鼠在感染后9周内PR26发挥免疫效应,此后免疫效应逐渐消失,可能是慢性期不产生抗PR26抗体之故[24]。

2.2.2 副肌球蛋白(paramyosin,PMY)PMY 位于肺期童虫和成虫的肌层、尾蚴的头尾部肌丝和腹吸盘以及肺期童虫的整个体被和基质[25],是人体IgA反应的主要靶抗原[7]。Klinna等[26]将PMY25重组表达后,经Western blotting分析,证实其与免疫动物血清及日本血吸虫病患者血清均可特异性结合。而Li等[13]报道,以重组PMY为抗原对我国湖沼地区的日本血吸虫病患者血清中的抗体型别进行分析后发现,男性患者体内总IgG、IgE、IgA、IgG4 和IgG2水平均高于女性患者,但与年龄无关。

2.2.3 脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein, FABP) FAB存在于雌虫卵黄颗粒及雄虫肌层下实质脂滴内[27]。Becker等[28]将日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因克隆至PQE-10表达载体,并在大肠杆菌中表达,此蛋白用镍螯合亲和色谱法纯化后可被患者血清识别。Brito等[29]研究发现,IgG1和IgG3是FABP的优势抗体,IgM、IgA、IgE的含量较低。

2.2.4 钙结合蛋白(calcium-binding protein, CaBP) 王兆军等[30]成功亚克隆了日本血吸虫CaBPSjE16编码基因,表达的重组蛋白能被日本血吸虫病患者血清识别,且在病兔药物治疗后SjE16重组蛋白迅速下降。作者认为, SjE16重组蛋白具有一定的诊断现症感染和考核疗效的潜能。

2.2.5 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3) 日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)广泛存在于日本血吸虫生活史各期虫体内,在人体内产生高滴度抗体, 其抗体与曼氏血吸虫和埃及血吸虫信号转导蛋白14-3-3均无交叉反应[31]。刘庆中等[32]定位了Sj14-3-3蛋白在成虫和童虫中的分布: 位于皮层、皮下层、肌层和实质层。查任远等[33]利用rSj14-3-3 检测急、慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原,均具较高的特异性和敏感性,且有较好的疗效考核价值,认为可用于血吸虫病的免疫诊断和流行病学现场调查。

2.3 抗独特型抗体-内影像抗原用抗独特型抗体Np30 检测治疗后的日本血吸虫病患者血清,抗体转阴率的敏感性明显高于SEA-ELISA 检测结果,治疗后3~12个月,其差异有统计学意义。此法简便、快速, 1h即可得结果, 用血量仅1μl,适用于现场大规模普查[34]。杨晓玲等[35]用Np30短程抗体检测125例各型血吸虫病患者,治疗1年后,抗体阴转率达80%,明显高于常规IHA法检测,可较好地评估疗效及人群虫负荷。

2.4 异源性抗原 异源性抗原是从异源生物的交叉成分中鉴定出、对血吸虫病有诊断价值的抗原。匙孔血蓝(keyhole limpet haemocyanin, KLH )是从一种海螺中提取的大分子糖蛋白, 常用作多肽免疫载体,与血吸虫各发育阶段均具有共同抗原分子,交叉反应的成分是多糖, 血吸虫抗SEA 抗体可识别KLH 的抗原表位[36]。秦志强等[37]应用皮试法对KLH和SEA 进行平行检测,结果显示KLH 作为诊断抗原用于现场调查,具较高的敏感性和较好的考核疗效价值。Beck等[38]研究表明,IgM-KLH -ELISA和IgG-KLH -ELISA可鉴别诊断急、慢性血吸虫病,KLH-ELISA显著优于SEA-ELISA。KLH 早已商品化,且价廉、纯度高、匀质性良好,作为诊断抗原值得在血吸虫病诊断中加以推广。水蛭可溶性抗原(leech soluble antigen, LSA)也是一种较重要的异源性抗原。秦志强等[39]经SDSPAGE及W estern blotting分析表明:LSA 的主要蛋白组分区带为8条,其中Mr为116000~118000、72000、45 000和32000的蛋白组分可被日本血吸虫病患者血清识别;LSA-ELISA与SEA-ELISA比较, 两者敏感性和特异性无显著性差异。邓振钦等[40]的研究发现, LSA 与血吸虫的共同抗原成分主要存在于成虫,LSA免疫血清中含有较高水平的抗雌性成虫抗体,而抗雄虫抗体较低。

2.5 噬菌体展示模拟抗原表位 余传信等[41]用纯化的日本血吸虫病患者血清抗体IgG对噬菌体展示库进行筛选,获得一批具有血吸虫抗原特异性的噬菌体展示抗原表位,其敏感性和特异性与SEA的检出率相似;且证明可用血吸虫病患者血清抗体从噬菌体肽库筛选出具有血吸虫病疗效考核价值的抗原表位[42]。朱晓华等[43]用噬菌体十二肽库筛选到的克隆对日本血吸虫病有较高的血清学诊断价值。雷家慧等[44]用两种方法筛选噬菌体肽库制备日本血吸虫抗原模拟表位:以日本血吸虫病患者血清免疫球蛋白作为靶分子,分别以噬菌体十二肽库和经过蚯蚓免疫兔血清免疫球蛋白筛选一轮后的噬菌体十二肽库为原肽库,两种方法均筛选到了对日本血吸虫病具有较高潜在诊断价值的抗原模拟表位。以异源性抗体结合后的肽库作为原肽库筛选寄生虫抗原模拟表位具有一定的可行性。

3 结语

日本血吸虫病的血清学诊断近年来已取得了一定进展,尚需进一步改进,力求简便、快速、高效、准确、达到标准化并能考核疗效。对特异性抗体及诊断抗原的研究可为血清学诊断的改进提供依据和条件。IgM、IgA可作为早期诊断的指标;总IgG能反映重症感染程度;IgG1可作为评价急、慢性血吸虫病病程的指标;重组抗原及异源性抗原具良好的应用前景。此外,循环抗原和循环抗体联合检测的推广应用,可提高检测的敏感性和特异性;采用无创伤性检测标本,例如尿液[45]、唾液[46],更适用于现场大规模流行病调查;加强质量控制, 使检测标准化、规范化以便推广应用。

参  考  文  献

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