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脊髓损伤基因治疗
2009-06-16 10:07   发布范围:公开

口腔医学系三队  曾 昊

摘  要脊髓损伤后的再生研究是科学家们不断探索的课题。Caja[1]等提出中枢神经系统(CNS)再生失败的原因不是发出神经纤维的神经元本身的缺陷,而是由于缺乏合适的微环境。基因治疗是近年来生物医学发展较快的领域,其基础研究和临床试验都表现出巨大的前景。基因治疗脊髓损伤既不存在胎儿神经组织移植的组织来源问题,又比外周神经组织移植引起的排异性低,是目前脊髓损伤治疗中最有前途的方法,但在中枢神经系统损伤的研究还处于实验阶段。基因治疗基本原理是利用转基因技术(物理、化学或生物),将某种特定的目的基因(重组DNA)转移到体内,使其在体内表达的基因产物发挥生物学活性。现在目的基因的选择和构建,表达栽体,转基因受体细胞、动物模型等方面已取得了一系列令人振奋的研究成果。基因治疗的转基因方式有两种:一是将目的基因直接导入体内靶细胞令其表达;二是将基因在体外导入适当的细胞内,并筛选出高效表达的移植细胞作为转基因中介移植到体内靶组织。不论采取何种方式,将基因导入细胞又可用多种手段实现:如微注射、脂质体等物理或化学手段;利用缺陷病毒作为栽体感染细胞的生物手段。[2]

关键词脊髓损伤;基因治疗;神经营养因子


0 引言

    近年来,人们将神经营养因子基因导入损伤处对脊髓损伤进行基因治疗取得了一定的研究进展。

1 SCI基因治疗相关的神经营养素家族(NGFs)

   神经营养索家族(NGFs)成员包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经生长因子(BDNF)、神经营养素-3[NT-3]、神经营养素一4/5(NT一4/5)、神经营养素-6[NT-6]等。随着多种NGFs的相继发现,许多学者在实验中发现中抠神经并非无再生和分化的可能。神经损伤后,神经元、靶细胞或胶质细胞可分泌多种NGFs,通过靶源性、自分泌、旁分泌方式与相应的神经细胞上特异性受体结合,激发各种信号通路而发挥其特殊的生物作用,促进中枢神经分化、生长和存活已有大量研究证实:SCI后可诱导自身组织细胞重新或加强NGF受体及NGFmRNA 的表达。外源性移植含有NGF的胚胎组织或细胞可促使神经元存活、轴突再生和功能恢复。但外源性组织移植存活时间较短,效应有限,离临床应用的距离尚远。随着分子生物学的发展,通过转基因技术,可使含有遗传基因的细胞不断分泌所需营养因子,促使神经再生。[3]

1.1 神经生长因子(neural growth factor,NGF)  NGF在幼年脊髓侧角神经元分布较多,白质和软脊膜细胞也有少量分布,而正常成年脊髓内没有分布。成年脊髓损伤后6h,蛛网膜及脊神经根附近出现NGFmRNA表达,在1d时达到峰值,而后逐渐下降[4]。脊髓损伤后向损伤处注射NGF实验表明,NGF可有效促进感觉神经纤维再生,对运动神经纤维也有一定的效果[5]。近年来Kim,Blesch,Weidner及Tuszynski等采取回体法(exvivo)将NGF导入脊髓损处,结果显示NGF能较稳定表达并促进了以感觉神经纤维为主的神经再生和功能恢复。

1.2 脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)  在新生脊髓灰质内许多神经元呈BDNF mRNA弱阳性,脊髓损伤后表达无明显化。在正常成年脊髓仅Rexed’SⅦ板层内少量神经元表达BDNF mRNA,脊髓损伤后1d,Ⅳ、V及Ⅶ板层内BDNF mRNA表达增高,但随后即逐渐降低。Kim,Menei,Liu等先后把BDNF基因修饰的靶细胞导入脊髓损伤处,结果显示BDNF可以保护运动神经元,减少萎缩和死亡,促进以运动神经纤维为主的神经再生。

1.3 神经营养素一3(Neurotrophin一3,NT一3)NT一3 mRNA在新生脊髓的腹角细胞有中等程度表达,成年脊髓内未见表达,脊髓损伤后没有明显变化。Grill,Zhang等曾将NT一3用于基因治疗脊髓损伤。NT一3具有广泛的生物活性,它的功能与BDNF有很强的相似性,能促进神经元及神经胶质细胞存活,促进成年大鼠横断的皮质脊髓束纤维再生,阻止神经元萎缩和死亡等等。[6]

2  SCI基因治疗的基础和方法

   基因转移(gene transfer)是指将外源基因导入受体细胞,其主要分为体外基因转移和体内基因转移,体外基因转移是指将在体外经遗传修饰的特定细胞移植到活体神经组织,使其表达和分泌特定分子,发挥生物学活性,促使神经功能恢复。而体内基因转移则是利用病毒载体或非病毒载体将外源基因直接导入神经组织,使其得以表达,发挥治疗作用。前者步骤复杂,但技术较为成熟,故目前使用较多。后者简便迅速,技术尚在完善中,但具有许多优点,更接近于临床应用。

2.1 体内法  即体内直接转基因(in vivo).即将目的基因直接导入体内靶细胞令其表达在动物实验中,重组腺病毒能介导基因进入脊髓并长期表达[7]治疗实验性的脊髓肿瘤,保护脊髓运动神经元,防止凋亡,减少神经性的疼痛。重组腺病毒能介导骨形态发生蛋白一2(bone morphogenic protein 2,BMP一2)表达,促进脊髓结缔组织的修复和异位骨化。在大鼠炎症性持续性疼痛模型中,Finegold等将表达内源性p一内啡肽的腺病毒介导入大鼠脑脊液,结果减轻了炎症性的感觉过敏而不影响正常的痛觉。Haase[8]等将携带神经营养因子3 (neurotrophin一3,NT一3)的重组腺病毒(AdNT一3)转入患进行性肌病的大鼠骨骼肌中,结果在脊髓的运动神经元中发现了AdNT一3,并且大鼠寿命延长,神经肌肉功能提高,神经元变性减少,肌肉的再神经化率增。Baumgart等将携带胶质源性的神经元营养因子(ial—derived neurotrophic factor,GDNF)的重组腺病毒转入脊髓横断损伤的新生鼠后肢骨骼肌中,结果在腰段脊髓的运动神经元中发现GDNF表达,并保护了运动神经元免于轴突断裂诱发的细胞死亡。

    基因治疗确实能介导基因产物的表达,但这些表达并不一定出现有效的结果。Warita等 用复制缺陷重组腺病毒将SOD一1基因转入转基因小鼠,虽然脊髓和肌肉中有病毒基因表达,但运动神经元仍进行性丧失。

2.2 体外法  即细胞介导的基因治疗(ex vivo),在体外将目的基因导入适当的移植细胞后.筛选出能够高效表达目的基因的移植细胞并移植到体内靶组织。目前SCI的基因治疗多采用exvivo的方法。Eaton[9]等在胚胎脑干中提取5一羟色胺能神经元,将携带脑源性神经营养因子(brain—derived nettrotrophic factor,BDNF)的腺病毒转入其中,再转移入坐骨神经卡压诱导的神经性疼痛的大鼠脊髓中,发现移植的细胞分泌5一羟色胺,并显著地抑制了疼痛,这些效应于移植后一周达到高峰。Menei等用携带BDNF,NT一3基因的复制缺陷重组腺病毒改造雪旺氏细胞 Schwann ceI1s,SCs),然后转入横断脊髓中,发现BDNF能显著地进轴突的再生。Ljichi[9]等将血小板源性生长因子(platelet—denved growth factor.PDGF)导人脊髓,以治疗放射性脊髓损伤。Rosenberg等是最早采用体外法来治疗SCI,将转染NGF的成纤维细胞移植人有穹窿病变的大鼠脑中,发现这些细胞不仅存活而且分泌大量的NGF,防止了胆碱能神经的退变。Blescha等将基因整合并高效表达白血病抑制因子(Leukemia inhibit0rv factor,HF)的成纤维细胞植入受损的脊髓内,2周后皮质脊髓束的轴突生长较对照组明显增快,而且损伤区内NT一3的台成量也明显增高,通过这种方法可促进受损脊髓功能的恢复。

    早期的转基因细胞主要是由单一的营养因子转染同源细胞而来。目前认为多个营养因子的共同作用可能更有效。例如分泌NT一3的胚胎干细胞在脊髓中移植后可以存活并迁徙很长距离。当有BDNF加入时,胚胎干细胞就分化成神经元,少突胶质细胞,星形胶质细胞“ 。可用的移植载体有少突胶质细胞的前体细胞,SCs,嗅鞘细胞,星形胶质细胞、肾上腺嗜铬细胞、成肌细胞、成纤维细胞。目前,用于SCI基因治疗研究的移植载体主要是成纤维细胞。然而最有潜力的是来源于正在发育的脊髓中的神经元前体细胞(neuronal—restricted precursors NRPs),这些细胞可在体外扩增并分化为各种神经细胞,包括运动神经元”。成年个体中枢神经系统特定部位也具有产生新生神经细胞潜能的前体细胞群,其数量和组成可通过加入各种不同的生长因子而改变。Shihabuddin等通过克隆分析,在碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF)存在下培养的成鼠前体细胞也具有自我复制和多种分化潜能。Okano等提出脊髓损伤后干细胞移植的最佳时间是损伤后1~2周,在这一段时间内,既解除了急性期各种炎症因子对植入细胞的损害,又避免了慢性期胶质瘤痕对轴突再生的干扰。[10]

3 脊髓基因治疗的展望

虽然目前关于SCI的基因治疗仍处于动物实验阶段,但却展现了十分诱人的临床应用前景 。随着分子生物学技术的发展,基因水平干预给中枢神经再生带来希望。今后可以把有丝分裂促进;fI的基因插入成熟神经元的基固组,成熟神经元便有可能一改不能分裂的状态而变为能够自行繁殖并能再生修补损伤所造成的缺损,从而使脊髓组织象外周神经那样具有生长愈合的能力。目前也可将对神经再生有利的基固,比如NGFs基因,导八自体工程细胞(如SC)增强其功能,更好地促进脊髓再生并恢复功能。并且,由于不同NGFs对各种神经元和突起生长的作用方式不同.任两者联用均可产生超过单一因子的作用,它既增强了疗效,又减少了副作用。因此,多种目的基因的导入治疗也是今后治愈神经损伤的方向之一。由于重组神经营养因子的生产和纯化,使应用NGFs治疗神经系统疾病成为可能。并且随着进一步对NGFs的功能、受体信号转导机制、各因子表达的调控和因子间相互作用等的阐明,随着NGFs与神经系统疾病病因的关系的阐明,随着转基因技术的进步,应用NGFs基因家族成员甚至其他基因治疗神经系统疾病仍不失为最为可行的途径,它们的应用必将成为现实。

参  考  文  献

1.  Cajal Y.Clausell A.Rabanal F.Membrane association and contactformation by a synthetic analogue of polymyxin B and its fluorescent derivatives[J].J Phys Chem B Condens Matter Mater Suoc lntece$Biophys,2006,110(9):44654471.

2.   王鸿飞Hong-Fei Wang,郑连杰Lian-Jie Zheng,刘用楫Yong-Ji Liu. 基因治疗脊髓损伤的前瞻性探讨[J].中国临床康复.第7卷,第26期, 2003,10:25.

3.   鲁凯伍.脊髓损伤基因治疗的研究进展[J].中国矫形外科杂志.2000年1月第7卷第1期.

4.   Widenfalk J,Lundstromer K,Jubran M,et a1.Neurotro—phic factor and receptors in the imrnature an d adult spinalcord after mechanical injury or kainic add[J].Neurosci,2001,21(10):3457-3475.

5.    Tuszynski MH,Gage FH.Maintaining the neuronal phe—notype after injury in the adult CNS.Neurotrophic fac—tops,axonal growth substrates, and gene therapy[J].MolNeurobiol,1995,10(2—3):151~167.

6.    郭家松,曾园山,李海标.基因治疗脊髓损伤研究进展[J].解剖与临床.2002年第7卷.第4期.Journal of Anatomy andClinicsVo1.7, No4.

7.   Liu Y,I-limes BT,Solowska J,et a1.1ntraspinal delivery ofneurolrophin一3using neural stern cells genetically modified by recombinant retrovirus[J].ExpNeurol,1999,158(1):9.

8.    Haase G,Petbnann B,Vigne E,et a1.Adcnovims—mediated transfer of the neurotrophin一3 geneinto skeletal muscled nnmice:therapeuticeffects and mechanism of action [J].J Neurol Sci,1998,160(Suppl I):97.

9.    Eaton K1,Whittemore SR.Autocfine BDNF secretion enhances the Burvival and serotonergic diferentiation of raphe neuronal precursor cells grafted into the adult rat CNS[J].Exp Neurol,1996,140(2):105.

10.  梁安霖,蒋电明.脊髓损伤的基因治疗[J]. 现代医药卫生2005年21卷第4期.

11.   侯铁胜.脊髓损伤基因治疗的研究进展[J].中国矫形外科杂志2000年1月第7卷第1期O~hop J CNa,Vol 7,No 1 Janl1ary 2000.

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